仿刺参SARM基因的克隆、表达和功能研究

采用RACE方法克隆了仿刺参TLR信号通路MyD88非依赖途径接头分子SARM,命名为AjSARM。AjSARM基因的序列全长3874 bp,开放阅读框为2412 bp,编码803个氨基酸。通过SMART软件对AjSARM蛋白进行蛋白结构预测,发现AjSARM蛋白由2个SAM结构域和1个C端TIR结构域组成。采用实时荧光定量PCR的方法检测AjSARM基因在仿刺参发育不同时期的表达量,发现在小耳幼虫期开始高表达,神经发育也是从这一时期开始的,表明AjSARM蛋白在仿刺参的发育过程中发挥了重要作用。仿刺参体腔细胞经过4种病原菌(灿烂弧菌、假交替单胞菌、希瓦氏菌和蜡样芽孢杆菌)刺激后,在灿烂弧菌、假交替单胞菌和希瓦氏菌刺激组,AjSARM基因在4 h和24 h的表达均受到抑制,然而在蜡样芽孢杆菌组,24 h表达上调。除了希瓦氏菌组外,其他3个组的AjSARM基因在96 h表达量达到最高。AjSARM在应对不同病原菌刺激后不同时间点所表现出的动态表达模式表明,它参与了仿刺参体腔细胞免疫应答的过程。通过对AjSARM的结构以及在不同发育阶段和不同病原菌刺激后的表达模式进行分析,探索仿刺参MyD88非依赖途径接头分子SARM的功能,可以为棘皮动物的发育和免疫系统进化研究提供参考。

虾夷扇贝酚氧化酶基因克隆及表达特性研究

酚氧化酶是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。该酶在无脊椎动物先天免疫防御中起着重要的作用。用分子克隆技术得到了虾夷扇贝酚氧化酶cDNA基因全序列，并利用Real‐TimePCR方法分析了酚氧化酶基因在虾夷扇贝不同组织中表达概况以及鳗弧菌注射后不同时段的相对表达量。试验得到的酚氧化酶基因全长1850bp，其包括长为1470bp的开放阅读框，编码489个氨基酸，5’UTR和3’UTR分别为37bp和343bp。实时定量分析研究显示，酚氧化酶基因在肝胰腺、外套膜、肾、闭壳肌、鳃和血中均有表达，其中外套膜表达最高。鳗弧菌注射后6h，酚氧化酶基因表达量显著低于对照组，而注射后12～36h，酚氧化酶基因表达量显著高于对照组，表明该基因可能在免疫过程中发挥重要作用。

仿刺参β-胸腺素基因的克隆和表达分析

β-胸腺素是一种具有抗菌活性的多肽。采用RACE方法克隆仿刺参β-胸腺素(β-Thymosin),命名为Ajβ-Thymosin。Ajβ-Thymosin基因的序列全长1877 bp,开放阅读框为126 bp,编码41个氨基酸;分子质量为4.6 ku,理论等电点为5.25。仿刺参β-胸腺素中存在着保守的功能序列EVASFD-KSKLK和保守的G-actin结合结构域LKKTET。系统发育进化分析结果显示,仿刺参β-胸腺素和紫色球海胆的β-胸腺素聚为一支。采用实时荧光定量PCR检测Ajβ-Thymosin基因在仿刺参不同组织和不同发育时期的表达量,发现其在体腔细胞中的表达量最高,在小耳幼虫期开始高表达。经过假交替单胞菌、灿烂弧菌、蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌4种病原菌刺激后,仿刺参体腔细胞中Ajβ-Thymosin基因的表达量在4 h均受到抑制;在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在12 h开始上调;在假交替单胞菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在24 h开始上调;在灿烂弧菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在48 h才开始上调。病原刺激产生的动态表达模式表明,Ajβ-Thymosin基因参与仿刺参体腔细胞免疫应答的过程,并且对不同病原菌的免疫应答能力不同。对Ajβ-Thymosin基因的序列和表达进行分析,可为新型抗菌肽和养殖病害防控策略的研发奠定基础。

虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与转录表达特性分析

利用RACE和克隆等方法得到了虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因全长cDNA序列,该序列全长1 064 bp,5'和3'非编码区(UTR)分别为61 bp和541 bp,开放阅读框(ORF)462 bp,编码153个氨基酸和一个终止密码子。分析发现,此氨基酸序列含有形成二硫键的两个半胱氨酸残基以及4个铜结合位点、4个锌结合位点,与已知的Cu/Zn-SOD结构相似,与其它物种同源性较高。进行虾夷扇贝组织分布及发育过程中不同时期的实时荧光定量监测,发现鳃中Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量最高,肾次之,血淋巴中最低;不同发育阶段Cu/Zn-SOD表达量变化明显,其中受精卵和早期D形幼体两个时期表达量相对较高。

仿刺参MyD88依赖途径基因的序列比较和表达分析

为探索仿刺参体内免疫调控机制,对TLR信号通路MyD88依赖途径中Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel的氨基酸序列保守结构域进行了比较分析,找到上下游基因之间可能的互作位点。采用实时荧光定量PCR的方法检测仿刺参体腔细胞中这6个基因在灿烂弧菌刺激后4个时间点的表达模式。试验结果显示,Toll在12 h表达小幅上调,在其他时间点都处于被抑制的状态;MyD88和TRAF6的表达模式基本一致,在12 h表达水平最高;IRAK4在12 h表达上调,在48 h恢复到初始状态;P105和Rel是NFκB的两个同源物,具有相似的结构域,并且这两个基因表达模式一致。通过基因序列和表达模式的对比分析发现,仿刺参体内存在一条高度保守的TLR信号通路。在应对灿烂弧菌入侵时,该通路上的6个基因协同合作参与了机体信号转导和免疫应答的过程。

远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区(ITS2)测序及分析

利用通用引物成果扩增了远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区序列,并对其进行了一致性比对和系统进化分析,结果表明:远东偏顶蛤ITS2序列全长共245bp,四个个体的序列无差异。与其他物种相比,与远东偏顶蛤一致性最高的物种为同属的偏顶蛤,系统进化树中,远东偏顶蛤与同属的其他两个种聚为一支。本文研究结果为该种的遗传进化及多样性研究提供了基础数据。