辽宁地区MN血型系统基因分型方法的建立及频率调查

目的建立MN血型系统基因分型的方法,并进行辽宁地区MN血型系统基因频率的调查。方法根据MN血型系统的基因序列结构,在第2、3外显子设计并合成基因分型上、下游引物,优化各实验条件后,建立聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)基因分型方法,对1 023例辽宁地区汉族无血缘关系的献血者进行MN血型的基因分型。采集的标本类型包括静脉血、血斑、口腔拭子(口腔黏膜脱落细胞),DNA提取分别采用血液基因组DNA提取试剂盒或Chelex-100方法。结果 1 023例辽宁地区汉族献血者MN血型的基因分型全部得出结果,并与血清学分型结果完全一致。其中MM纯合子242例,占23.66%,MN杂合子520例,占50.83%,NN纯合子261例,占25.51%。经计算,M基因频率0.490 7,N基因频率0.509 3,χ2=0.294 8,P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡。结论建立了MN血型系统的PCR-SSP基因分型方法,具有方法稳定、结果可靠,取材广泛等优点,适合于常规应用、法医亲子鉴定和个体识别。MN血型的基因频率存在明显的地域和人群差异,与其他地区和人群相比,辽宁地区汉族人群的MN血型系统基因频率具有本地区的分布特点,可应用于群体遗传学研究、疾病相关性研究等。

辽宁地区汉族献血人群Diego血型基因频率调查及稀有血型库的建立

目的对辽宁地区汉族献血人群Diego血型基因频率调查,建立辽宁地区稀有血型资料库。方法根据Diego血型的基因序列结构设计引物,优化PCR-SSP基因分型的实验方法,对1 298例辽宁地区汉族献血者血液标本进行Diego血型基因分型,并对其中55例标本进行血清学方法检测加以验证。结果应用已优化的PCR-SSP基因分型方法对1 298例辽宁地区汉族献血人群进行Diego血型的基因分型,其中Di^aDi^a检出1例,占0.08%,Di^aDi^b检出67例,占5.16%,Di^bDi^b检出1 230例,占94.76%。经计算,Di^a基因频率0.026 6,Di^b基因频率0.973 4,χ^2=0.009 8,P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡定律,其中55例标本经血清学方法检测结果完全一致,并由此建立了辽宁地区Diego稀有血型资料库。结论应用PCR-SSP基因分型方法,调查了辽宁地区汉族献血人群Diego血型基因频率,具有本地区本民族的分布特点。建立了辽宁地区Diego稀有血型资料库,进一步保障输血安全。

滤白机采血小板消除白细胞干扰血小板RNA实验的研究

目的探讨滤白机采血小板中混入的少量白细胞对血小板RNA相关检测的影响及进一步去白细胞的方案。方法将滤白机采血小板进行分组处理。1)对照组:直接离心收集血小板细胞;2)离心纯化组:将血小板分别以不同离心力进行离心,收集沉淀细胞组分、回收悬浮细胞组分;3)磁珠纯化组:用磁珠法去除血小板中的CD45阳性白细胞,回收CD45阴性血小板细胞。分别提取以上细胞的总RNA,并逆转录合成cDNA。以cDNA为模板PCR扩增管家基因β-actin、血小板标志物ITGA2B、白细胞标志物PTPRC基因片段。根据扩增产物电泳结果判断血小板中的白细胞对血小板mRNA检测的影响,以及离心纯化法和磁珠纯化法去白细胞的效果。结果滤白机采血小板直接离心所得细胞、滤白机采血小板以不同条件离心后收集的沉淀细胞和悬浮细胞,其cDNA中白细胞标志物PTPRC cDNA检测均呈阳性;磁珠法纯化后血小板cDNA中PTPRC cDNA检测呈阴性。结论滤白机采血小板中混入的少量白细胞可干扰血小板RNA相关检测。简单离心法不能去除血小板中的白细胞污染,但磁珠法可有效进一步去除白细胞。

ABO血型不合异基因造血干细胞移植后血型转换期的输血策略

背景:造血干细胞移植是目前临床治愈血液系统恶性肿瘤、先天性遗传性疾病以及自身免疫性疾病的重要手段,ABO血型不合的异基因造血干细胞移植并不影响造血干细胞的植活,但ABO血型不合在移植后血型转换期输血时应该制定何种输血策略值得研究。目的:研究ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后血型转换期血型抗原抗体的变化及输血时血液的选择策略。方法:应用血型鉴定、抗体检测、抗体效价测定、交叉配血等方法,对24例ABO血型不合的异基因造血干细胞移植患者,在血型转换期进行血型抗原抗体的监测和输血前相容性检测,并与同期30例血型相合的异基因造血干细胞移植患者进行比较,选择适合的血液。结果与结论:24例ABO血型不合患者于移植后全部获得造血重建,但在红系恢复时间上,主要血型不合组和主次要均不合组的时间均有延长,差异均有显著性意义(P<0.05)。根据血型转换期监测的ABO抗原和相应抗体发生的变化,主要ABO血型不合移植者在血型转换期均输注了患者型红细胞;次要血型不合者根据抗原减弱的情况,从输患者型过渡到输供者型红细胞;主次要均不合的患者,从首先输注O型洗涤红细胞再过渡到输注供者型红细胞,24例患者均未发生任何溶血性输血反应。因此ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后的输血策略,应根据患者血型转变情况及抗体效价动态变化,权衡所选血型对造血重建的影响,选择合适的血液成分输血,可避免溶血性输血反应且不影响干细胞植活及血型转换时间,保证患者移植安全。

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

背景:近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:探索中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法:应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术,对1名27岁男性汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论:PCR-序列特异性寡核苷酸探针结果显示该样本HLA-B基因座反应格局出现异常提示;基因测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列最相近的等位基因B*55:02:01的差异只是在第3外显子发生了nt 412 A→G一个核苷酸替代,导致第138位密码子由AAC→GAC,相应的编码的天冬酰胺改变为天冬氨酸。将其序列提交国际基因数据库及IMGT/HLA数据库,证实该HLA等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-B*55:46(HM989018)。

血小板CD36新等位基因1142T>G序列分析及确认

背景:作为血小板上的主要抗原之一,CD36抗原又被称为血小板糖蛋白Ⅳ,其基因变异会导致CD36抗原缺失。目的:序列分析并确认1例CD36抗原新等位基因。方法:提取外周血样本DNA,应用聚合酶链式反应扩增CD36基因的12个编码区序列片段,应用直接测序法对目的片段的序列进行检测。所得序列与基因库中编号为NG_008192的标准序列进行比对分析,以确定新的基因突变。结果与结论:被检样本在第12外显子的1142位发生T>G的碱基突变,其他外显子序列与标准序列一致。检索国际基因数据库Gen Bank和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI),均未发现关于1142 T>G突变的数据和报道,因此为国际上首次确认,上报Gen Bank获得登录号:KM275213。1142 T>G突变导致第381位氨基酸由亮氨酸(Leu,L)改变为丝氨酸(Ser,S),两者在亲/疏水性和极性上差异较大,且381位氨基酸所在区域为高度保守区域,因此推测该突变会使蛋白活性降低甚至消失。

人类白细胞抗原新等位基因B＊07：110的序列分析及确认

背景:近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:采用序列分析确认1例中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法:应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术进行样本的人类白细胞抗原基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论:聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针结果显示,该样本人类白细胞抗原B基因座反应格局出现异常;基因测序结果表明,其B基因座第2外显子序列与所有已知人类白细胞抗原B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列同源性最高的等位基因B*07:01:02的差异是在第2外显子发生了nt 226和nt 228两个A->G核苷酸取代,导致第76位密码子由ATA->GTG,相应的导致氨基酸由异亮氨酸(I)改变为缬氨酸(V)。将其序列提交国际基因数据库(Gen Bank)及IMGT/HLA数据库,证实该新人类白细胞抗原等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原B*07:110(HM989017)。

1例B(A)_(02)鉴定报告

目的对检验过程中发现的一例特殊血型进行鉴定,并对结果进行分析。方法采用血型血清学进行ABO血型正反定型试验,并根据需要追加红细胞与抗血清吸收放散试验和血浆中血型物质检测。并利用PCR-SSP方法来检测其ABO基因及进行人红细胞ABO cisAB与B(A)血型基因分型检测,同时对DNA序列进行分析。结果在该患者体内发现B(A)02基因,且血清学有相应的反应格局。结论对ABO血型血清学正反定型不符的标本,可以用分子生物学方法进行辅助验证。

血小板CD36抗原Ⅱ型缺失与内含子序列多态性的相关性

目的研究分析血小板CD36抗原Ⅱ型缺失与内含子序列多态性的相关性。方法随机抽取辽宁省血液中心健康血小板捐献者516名,其中241例分别进行CD36抗原检测和CD36基因序列分析;剩余275例只进行CD36基因序列分析。CD36抗原检测采用流式细胞术法,基因序列分析采用PCR-SBT法。结果在241例标本中检测到Ⅰ型缺失1例和Ⅱ型缺失4例,频率分别为0.41%和1.66%。3例Ⅱ型缺失者编码区无突变。所有Ⅱ型缺失个体在内含子3区域具有共同的多态性特征,即同时携带(TG)11和12个串联突变,且两者位于同一等位基因。(TG)11在516例随机人群中的基因频率仅为11.72%,远低于(TG)13的30.43%。12个串联突变在516例随机人群中的基因频率为8.81%。96.7%的12个串联突变都与(TG)11同时出现,但只有72.7%的(TG)11携带12个串联突变。流式细胞术检测发现,只携带(TG)11的标本,其血小板CD36抗原表达水平与正常标本相当,而93.1%的同时携带(TG)11和12个串联突变的标本血小板CD36抗原水平明显降低。结论内含子3区域内的(TG)11不是血小板特异性沉默因子,但它们之间存在某种间接的相关性。(TG)11与12个串联突变具有较强连锁关系。血小板特异性沉默因子可能有多个。

人类白细胞抗原新等位基因HLA—A＊31：22的序列分析及确认

目的序列分析及确认一例中国人群中的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）新等位基因。方法应用基于Luminex平台的聚合酶链反应一序列特异性寡核苷酸探针（PCR—SSOP）基因分型法、PCR产物测序法和组特异性引物测序法，通过软件分析该样本DNA基因序列及与最相近HLA等位基因序列的差异。结果PCR-SSOP结果显示该样本HLA．A基因座的反应格局与已知HLA—A等位基因均不一致；DNA序列分析显示，在所检测的第2—4外显子中，该样本HLA．A基因座序列与所有已知HLA-A等位基因序列均不一致，与同源性最高的等位基因A＊31：01：02的差异只在外显子2区域中产生了nt245A-c-个碱基取代，并导致相应的82位密码子由GAG—GCG，编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）变为丙氨酸（Ala）。结论该基因为HLA新等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA—A$31：22。

新等位基因HLA-B＊37：04．02的序列分析

目的确定1名中国人的HLA新等位基因。方法应用聚合酶链反应一序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes，PCR-SSOP）基因分型技术和基于测序的分型方法（sequencing-based typing，SBT）对1名中华骨髓库辽宁分库志愿捐献者的HLA基因进行分型，通过软件分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果PCR-SSOP结果显示，该个体HLAB基因座反应格局出现异常；测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致，与序列最相近的等位基因B＊37：04：01在所检测的第2和3外显子中的差异只是在第3外显子发生了nt618G〉A1个核苷酸替代，导致相应的第206位密码子由GcG〉GCA，但第206位编码的丙氨酸并未改变。结论该基因为HLAB新等位基因，被世界卫生组织HLA因子专用术语命名委员会正式命名为HLA-B＊37：04：02（GU391034）。

HLA新等位基因HLA-B＊08∶57的核苷酸序列分析

对沈阳地区血小板志愿捐献者资料库常规HLA基因检测，发现并认定1例新的HLA等位基因，2010年已被世界卫生组织正式命名为HLA-B＊08∶57，现报告如下。

FUT1基因两种新的变异检测与一例类孟买型血型的家系分析

目的鉴定罕见的类孟买型Bm^(h),并研究其分子遗传背景。方法应用血清学方法鉴定先证者及其家系成员的红细胞ABO及H表型,采用聚合酶链反应-序列特异性引物基因分型方法检测先证者ABO血型基因型。应用扩增产物直接测序法和克隆测序法分析类孟买表型家系的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(FUT1)编码序列。结果先证者为罕见的类孟买Bm^(h)型,ABO基因型为ABO*B.01/ABO*O.01.01型,测序发现FUT1基因存在c.508dupT及c.787A>C两种变异,FUT1基因型为h^(508dupT)/h787C。蛋白活性分析软件预测这两种变异均会造成酶失活,与血清学结果一致。结论鉴定了c.508dupT及c.787A>C两种FUT1新等位基因,尚未见报道,且其为引起先证者类孟买表型的分子机理。

HLA新等位基因HLA-DRB1＊09：01：07的序列分析及确认

目的研究并确认在中国汉族人群中发现的1个HLA新等位基因序列。方法应用聚合酶链式反应一序列特异性寡核苷酸探针（polymerase chain reactionsequence—specific oligonucleotide probes，PCR—SSOP）基因分型技术和基于测序的分型技术（sequencing-based typing，SBT）对1名中华骨髓库辽宁分库汉族捐献者的HLAA、-B、-DRB1基因进行分型，通过软件分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果PCR—SSOP分型时该个体HLA—DRB1基因型为DRB1＊09：03，15GEP，但探针反应格局出现异常；测序结果为DRB1＊15：01：01和一个DRB1＊09新等位基因，比较新等位基因与序列最相近的等位基因DRB1＊。9：01：02在nt306 C→T，导致相应的第73位密码子GCC→GCT，但其编码的氨基酸未改变，仍为丙氨酸。结论发现一个HLA—DRB1新等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA—DRB1＊09：01：07。