DJ-1^(L166P)与DJ-1^(M26I)基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P<0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P<0.05)。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。

BECN1与肿瘤关系的研究进展

BECN1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因,与肿瘤的发生发展密切相关。本文通过介绍BECN1的基本结构、相关作用蛋白及其相关自噬机制,总结了BECN1与自噬、凋亡及其肿瘤的关系,并探讨其在肿瘤治疗领域中的潜能。

小鼠生殖细胞特异性转录因子NOBOX调控初级卵泡发育机制的研究

目的NOBOX是在原始卵泡激活过程中起关键作用的转录因子,可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化,但其在初级卵泡及之后的具体调控机制并不清楚。Kit作为影响卵泡发育的重要基因,其启动子存在多个NOBOX结合位点。本研究拟探索在初级卵泡发育阶段,转录因子NOBOX对Kit的转录调控作用,以及通过GDF9/SMAD通路对卵泡发育的影响。方法体外培养初级卵泡统计发育时间;qRTPCR检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9的mRNA表达变化;Western blot检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中NOBOX、KIT、P-SMAD的蛋白表达变化;ChIP实验验证转录因子NOBOX在Kit基因启动子上的结合位点。结果初级卵泡在体外培养第5天可发育为次级卵泡,注射Nobox-siRNA的初级卵泡延缓2 d发育至次级;初级卵泡中注射Nobox-siRNA后,卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9 mRNA表达显著下调,NOBOX、KIT、PSMAD2/3蛋白表达量降低;转录因子NOBOX可以结合于Kit基因启动子。结论NOBOX是小鼠初级卵泡发育至次级卵泡的关键基因,NOBOX可直接结合Kit基因启动子,且影响初级卵泡中KITL/KIT和GDF9/SMAD通路。

pcDNA3．1／myc-His-DJ-1^M26I真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞中表达

目的构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，为进一步研究DJ-1^M26I基因的功能及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3．1／myc-his—DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc—his-DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平鉴定。结果pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his—DJ-1^M26I质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后，经PCR检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆，RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测，结果均证明外源插入基因的表达，MTT实验结果初步证明转染DJ-1^M26I基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0．05）。结论成功构建pcDNA3．1／myc-his-DJ-1和pcDNA3．1／myc-his-DJ-1^M26I重组表达质载体。

一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法

在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。