辽宁地区腹泻患者大肠杆菌分离株Ⅱ型不耐热肠毒素的检测及测序分析

目的对辽宁地区人源性腹泻样本中致病性大肠杆菌(Pathogenic Escherichia coli)的毒力因子进行检测,掌握产Ⅱ型不耐热肠毒素(Type Ⅱ heat labile enterotoxin,LT-Ⅱ)大肠杆菌在我国北方地区的流行现状并阐明LT-Ⅱ与其他致病因子间的关系。方法于2014年3月至2015年3月收集辽宁地区人源性腹泻粪便样品,用麦康凯培养基和生化试验的方法分离出大肠杆菌,并用多重PCR方法对毒力基因(elt-Ⅱ、elt-I、sta、stb、K88、K99等)进行检测,对分离到的LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中elt-Ⅱ基因进行测序及分型。结果 354份腹泻样品中共分离到携带有毒力因子的大肠杆菌139株,检出率为39.2%。毒力因子阳性大肠杆菌中,有12株携带elt-Ⅱ(8.6%)基因。在12株携带elt-Ⅱ的大肠杆菌中,2株单独携带elt-Ⅱ,6株携带F1,1株携带K88,1株携带astA,2株携带irp2/astA;测序结果表明12株elt-Ⅱ阳性大肠杆菌中有10株携带elt-Ⅱc1亚型,2株携带elt-Ⅱc4亚型。结论在引起人源性腹泻的毒力因子中有大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒的存在,且主要以LT-Ⅱc1为主要流行型。

交叉引物扩增法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的研究

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)可引起严重食源性疾病,建立快速、准确的检测方法对保障食品安全和人类健康具有重要意义。对ETEC不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)基因保守序列设计交叉引物等温扩增(cross priming amplification,CPA)特异性引物,同时对反应温度、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTPs)浓度、Bst-DNA聚合酶大片段浓度、Mg^(2+)浓度、甜菜碱浓度和反应时间进行优化;选取6株大肠杆菌和其他8株近源菌对CPA法进行特异性和敏感性分析;将纯培养后的产肠毒素大肠杆菌菌液稀释后随机污染46份不含LT肠毒素的生猪肉样品以评价该方法的应用效果。结果表明,CPA的最优反应温度为62℃、dNTPs浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管、Mg^(2+)浓度为2.0 mmol/L、甜菜碱浓度为0.8 mol/L、反应时间为45 min;CPA方法检测产肠毒素大肠杆菌菌液的最低检出量为40 cfu/mL,为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法的2倍,且特异性较高;46份人工污染生猪肉样品中共检测出阳性样品7份,CPA扩增结果与LAMP和荧光定量聚合酶链反应结果一致,检出率均为15.2%。

大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素快速检测方法的建立与应用

为了建立新型、快速的大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)的检测方法,试验采用LT-Ⅱ家族的保守序列设计交叉引物等温扩增技术(cross priming amplification,CPA)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,分别对这两种方法的反应温度、Bst聚合酶浓度和扩增时间进行优化,进一步对反应的特异性和敏感性进行研究,最后用这两种方法检测156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本,并以实时荧光定量PCR方法作为参照进行对比。结果表明:建立的LAMP和CPA方法对LT-Ⅱ基因具有很好的特异性,LAMP和CPA方法的最低检出限分别为6. 7×102cfu/m L和6. 7×101cfu/m L,CPA法具有更高的敏感性。对156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本的检出率为7. 7%(12/156),CPA、LAMP和实时荧光定量PCR三种检测方法的一致性为100%。说明建立的CPA方法不仅具有较高的特异性和敏感性,且不需要昂贵的仪器即能在短时间内完成靶基因的检测。