包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因(腺病毒早期表达基因)的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多(P<0.05);PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。

纳米粒子介导E1A基因体外转染人甲状腺未分化癌细胞HTC／3

目的探讨纳米粒子介导E1A基因转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3的可行性和效率,并检测转染细胞对X线的敏感性和X线诱导转染细胞凋亡。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3,并以阳离子脂质体为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)方法检测转染细胞(HTC/3-E1A)的E1A基因mRNA表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HTC/3-E1A细胞、对照细胞的体外生长率和不同剂量X射线对HTC/3-E1A细胞的生长抑制率。HTC/3-E1A细胞经一定剂量X线(2 Gy)照射后,用流式细胞仪进行细胞周期分析,DNA电泳观察细胞凋亡。结果制备的纳米粒子直径为150-280 nm,包埋率为0.78%,体外释放约为18 d。在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数多于脂质体组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因mRNA表达。HTC/3-E1A细胞群体生长缓慢,倍增时间延长(是亲本细胞的1.44倍)。HTC/3-E1A细胞对X线敏感性较转染空载体细胞(HTC/3-Vect)和HTC/3细胞分别提高约2.9倍和2.8倍。流式细胞仪分析显示,HTC/3-E1A细胞亚G0/G1期比例显著高于HTC/3-Vect和HTC/3细胞(P均<0.01),S期比例显著低于HTC/3-Vect细胞和HTC/3细胞(P均<0.01)。DNA电泳显示,HTC/3-E1A细胞出现典型的凋亡梯度变化,而HTC/3-Vect和HTC/3细胞无此变化。结论纳米粒子可携带外源基因进行基因转染并获得表达,转E1A基因HTC/3细胞对X线敏感性明显提高,且X线诱导了转E1A基因HTC/3细胞凋亡。

脂质体介导E1A-TK基因转染人肺腺癌细胞A549体外研究

目的用脂质体转染真核表达质粒PcDNA3E1A-TK入人肺腺癌细胞A549,观察丙氧鸟苷(GCV)、X射线及二者联合对转染细胞的体外杀伤作用。方法用阳离子脂质体介导真核表达质粒PcDNA3E1A-TK转染人肺腺癌细胞A549,PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A-TK基因DNA整合、mRNA表达。MTT法测不同浓度GCV、不同剂量X射线及一定剂量X线照射后再给一定量GCV对转染细胞的生长抑制率。结果PCR、RT-PCR结果表明转染细胞有E1A-TK基因整合、mRNA表达。根据IC50,转染细胞对GCV、X射线的敏感性分别比亲代细胞提高111.3倍和2.9倍,在作用相同时间后,GCV+X线照射治疗对转染细胞的生长抑制作用比单纯GCV或X线治疗明显增强(P<0.01)。结论脂质体介导外源基因E1A-TK成功转入人肺腺癌A549细胞并获得表达;转染细胞获得了对GCV和X线的敏感性,GCV和X线对转染细胞有协同杀伤作用。