miRNA-126基因敲减小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞比例的变化

目的:研究miRNA-126基因敲减小鼠肠系膜淋巴结T及B淋巴细胞数量的变化。方法:检测miRNA-126基因敲减(KD)小鼠肠系膜淋巴结的体积、重量和淋巴结细胞总数;HE染色检测小鼠肠系膜淋巴结的病理形态学变化;流式细胞术(FACS)检测淋巴结中T及B淋巴细胞数量的变化。结果:与野生型(WT)小鼠相比,miR-126KD小鼠肠系膜淋巴结体积、重量和淋巴结细胞总数均显著增加(P<0.05),且病理形态学发生异常;肠系膜淋巴结中B淋巴细胞比例和数量无变化(P>0.05),CD4+T细胞数量无变化,而CD4+T细胞百分数明显减少(P<0.05),CD8+T细胞百分数和绝对数量均显著增加(P<0.05)。结论:miRNA-126敲减后可显著影响肠系膜淋巴结中T淋巴细胞的数量,提示miRNA-126可能影响肠系膜淋巴结的免疫功能。

microRNA-126基因敲减小鼠的鉴定及其血糖水平变化

目的:检测micro RNA-126(mi R-126)基因敲减(knock down,KD)小鼠各组织器官中mi R-126的表达,并观察小鼠血糖的变化,初步探讨其意义。方法:分别提取野生型(wild type,WT)和mi R-126 KD模型小鼠中12种组织器官的总RNA,荧光定量PCR探针法检测mi R-126在12种组织器官的表达水平;检测小鼠血糖的变化,并观察小鼠体质量的变化;HE染色观察肝脏和胰腺的病理改变。结果:与正常小鼠相比,mi R-126 KD模型小鼠的脾、胰腺、肝、肌肉和肺等器官组织中mi R-126的表达显著下调(P<0.05);出生第7周和第16周模型小鼠血糖水平均明显增高(P<0.05),HE染色显示模型小鼠胰腺和肝组织呈明显病理异常;出生第13周后,模型小鼠体质量逐渐增加(P<0.05)。结论:mi R-126KD小鼠血糖水平明显增加,可能与胰腺和肝的病理改变有关,提示mi R-126在血糖代谢中具有重要作用,可能与2型糖尿病的发生发展密切相关。

microRNA-7对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞组成的影响

目的:研究miR-7(MicroRNA-7,miRNA-7)对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞比例的影响并初步探讨其意义。方法:利用miR-7基因敲减(Knockdown,KD)小鼠模型,观察其肠系膜淋巴结大小、重量和淋巴结细胞总数,以及HE染色的病理学变化;流式细胞术(FACS)检测淋巴结中αβT淋巴细胞亚群(CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化相关分子CD69、CD62L和功能相关因子IFN-γ表达的情况。结果:与野生型(Wild type,WT)小鼠相比,miR-7KD小鼠肠系膜淋巴结大小、重量指数和淋巴结细胞总数均显著增高(P<0.05),且HE染色显示MLNs有病理性改变;肠系膜淋巴结中αβCD3+T细胞比例增加显著,其中以CD4+T细胞比例变化最为明显(P<0.05),而CD19+B淋巴细胞比例明显下调(P<0.05),但各亚群细胞总数均明显增加(P<0.05);最后,CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD62L+细胞的比例均显著下调(P<0.05),而CD69+细胞和IFN-γ+细胞比例均显著上调(P<0.05)。结论:miR-7敲减后可显著影响肠系膜淋巴结中αβT淋巴细胞的组成比例,提示其对肠系膜淋巴结中淋巴细胞的组成和功能具有重要的调控作用。

过表达miRNA-7对乳腺癌4T1细胞体外生长的影响

目的探讨过表达miRNA-7(miR-7)对乳腺癌4T1细胞体外生长的影响。方法将真核表达载体pcDNA3.1-miR-7(p-miR-7)体外瞬时转染乳腺癌4T1细胞后,Real-time PCR探针法检测细胞中miR-7的表达;CCK-8法及克隆形成实验观察细胞的增殖和克隆形成情况;划痕法观察细胞体外迁移能力的变化;Western blot检测细胞Akt与p-Akt蛋白表达的变化。结果与对照组比较,p-miR-7载体转染组细胞miR-7的表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);细胞增殖和克隆形成能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);划痕实验进一步显示p-miR-7载体转染组细胞的体外迁移能力显著削弱,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示细胞p-Akt蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达miR-7能明显抑制乳腺癌细胞的体外生长能力,可能与Akt信号通路传递改变有关。

miRNA-7在小鼠不同组织器官中表达的检测及其意义

目的采用Real-time PCR方法来检测miRNA-7在小鼠12种不同组织器官中的表达情况并探讨其意义。方法首先分别提取小鼠12种组织器官总RNA,用miRNA-7特异性引物逆转录为cDNA,采用Real-timePCR探针法检测miRNA-7在12种组织器官中的表达水平。结果成功应用Real-time PCR方法检测miRNA-7在小鼠12种组织器官中的表达水平,结果显示,miRNA-7在肺组织中的表达水平最高,而在淋巴结中的表达水平最低。此外,在小肠、脑、胸腺、脾脏中也存在miRNA-7的高表达。结论 miRNA-7在小鼠的肺、小肠、脑、胸腺、脾脏中呈较高水平的表达,提示该分子可能在上述器官的发育、分化、功能维持及相关疾病发生中具有重要作用,为后续深入研究miRNA-7的生物学功能提供了前期试验依据。

PRDX2基因沉默促进结直肠癌细胞上皮-间质转化增强侵袭转移能力

目的探讨Peroxiredoxin 2(PRDX2)基因沉默在结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)中的作用及其参与侵袭转移的可能机制。方法将带有抗性的对照shRNA(shRNA-Control)和PRDX2 shRNA(shRNA-PRDX2)慢病毒颗粒分别转染结直肠癌SW480细胞,转染后细胞分为PRDX2沉默组(shRNA-PRDX2)和空载对照组(shRNA-Control)。采用免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分别检测两组细胞中PRDX2蛋白和mRNA表达;以5 ng/m L的TGF-β1作用两组细胞,在0、48、72 h观察两组细胞形态学变化;划痕实验和Transwell小室分别检测两组细胞体外迁移和侵袭能力;Western blot和qRT-PCR法检测E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9蛋白及mRNA表达。结果与对照组相比,PRDX2沉默组细胞PRDX2蛋白和mRNA的表达显著降低(P<0.05),成功建立PRDX2基因沉默稳定细胞株;经TGF-β1作用后,PRDX2沉默组细胞呈纺锤体样间质细胞表型,且迁移和侵袭能力明显增强;E-cadherin蛋白及mRNA水平表达显著下降,Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9蛋白及mRNA表达水平均明显增加(P<0.05)。结论 PRDX2基因沉默可促进结直肠癌SW480细胞发生EMT,从而增强细胞的侵袭和转移能力,可能与其转录调节Snail、Twist1表达有关。

自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

目的构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体,研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法预测miR-7启动子序列,设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物,PCR扩增后亚克隆入p GL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体p GL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro);将所构建载体转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平;MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力;划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化;FACS检测95D细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体,转染95D细胞后可有效表达miR-7;与对照组相比,p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05,P<0.05);同时其迁移能力也显著降低(473±7 vs 99±2,P<0.05);而细胞凋亡则显著增加(9.233±0.586%vs 12.967±0.643%,P<0.05)。结论成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体,为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础。

pG-miR-7-Sponge转基因小鼠载体的构建及鉴定

目的构建pG-miR-7-Sponge转基因小鼠的真核载体并检测其表达活性,为转基因小鼠的建立提供前期实验基础。方法利用miRNA sponge(海绵体)技术原理,合成miR-7-Sponge序列,酶切连接入真核表达载体eGFP-C2并转化Stbl3感受态细胞,克隆PCR、酶切和测序鉴定重组载体eGFP-C2-miR-7-Sponge(简称pG-miR-7-Sp);将重组载体pG-miR-7-Sp体外瞬时转染人肺癌95D细胞,荧光显微镜下观察细胞的GFP表达情况;Real-Time PCR检测细胞中miRNA-7的表达;MTT法检测细胞的增殖变化。结果经克隆PCR、酶切鉴定及测序分析,成功构建了真核表达载体pGmiR-7-Sp;pG-miR-7-Sp瞬时转染95D细胞48 h后,与对照组细胞相比,miR-7表达水平明显降低(P<0.05);同时细胞的生长明显加快(P<0.05)。结论成功构建pG-miR-7-Sp真核表达载体。

TTF-1启动子调控microRNA-7真核表达载体的构建

目的构建甲状腺转录因子(TTF-1)启动子调控miR-7表达的真核表达载体,并观察其表达miR-7对人肺癌细胞体外生长的影响。方法抽提人肺癌95D细胞基因组DNA,PCR分别扩增TTF-1启动子序列(promoter)和miR-7前体序列,纯化产物分别经Kpn I/Mul I双酶切和Mul I/HindⅢ双酶切,克隆入PGL3-basic-载体,构建pGL3-basic-TTF-1-promoter-miR-7真核表达载体(命名为p-T-miR-7);将p-T-miR-7真核载体体外瞬时转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测细胞中miR-7的表达水平;CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖情况;划痕实验检测转染后细胞的体外迁移情况。结果经酶切和测序鉴定成功构建TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体p-T-miR-7;转染后72 h,与对照相比,p-T-miR-7转染组中miR-7的表达水平增加约2.5倍(P<0.05);CCK-8实验和克隆形成实验显示,p-T-miR-7转染组中95D细胞的增殖能力明显下降(P<0.05);划痕实验进一步显示,细胞的体外迁移能力也显著削弱(P<0.05)。结论成功构建TTF-1启动子调控的miR-7真核表达载体,这为后续肺癌基因治疗策略开发提供重要前期实验基础。

重组人IL-10在毕赤酵母X-33及SMD1168中表达效率的比较

目的研究重组人IL-10(rhIL-10)在两株毕赤酵母X-33和SMD1168的表达水平,为rhIL-10的表达选择合适的表达菌株。方法以0.5%甲醇分别诱导毕赤酵母X-33和SMD1168表达rhIL-10,用SDS-PAGE和WesternBlot分析和鉴定rhIL-10,用ELISA法测定培养液rhIL-10含量,用Bradford法测定培养液总蛋白含量并计算rhIL-10占总蛋白的比例。比较同等培养条件下两株酵母表达rhIL-10和总蛋白的水平。结果 SDS-PAGE和Western Blot均检测到42kD左右的蛋白条带;rhIL-10在X-33中的表达量平均达20.00mg/L,在SMD1168中的表达量平均达1.90mg/L,在两株不同酵母中的表达量有显著性差异(P<0.05);同时段的X-33培养液中总蛋白质含量平均为50.00mg/L,rhIL-10占总蛋白的40.00%;SMD1168培养液中总蛋白质含量平均为48.23mg/L,rhIL-10占总蛋白的4.00%。结论 rhIL-10在不同的毕赤酵母表达效率有差异,X-33较1168更适于rhIL-10的表达。

DHHCs家族成员在小鼠CD4^+CD25^-T细胞和CD4^+CD25^+调节性T细胞活化中的表达及意义

目的观察DHHCs家族成员在小鼠CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞活化前后的表达情况并探讨其意义。方法磁珠法从小鼠脾脏分选CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞,流式细胞术检测纯度后,体外用anti-CD3e/CD28抗体分别刺激其活化。TRIzol法提取细胞总RNA,RT-PCR逆转录成cD-NA,分别用24个DHHCs家族成员特异性引物进行PCR反应,对产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果活化前CD4+CD25-T细胞高表达DHHC5、DHHC14和DHHC18,活化后其上调表达DHHC2、DHHC4、DHHC6、DHHC8、DHHC9、DHHC12、DHHC15和DHHC16;活化前CD4+CD25+调节性T细胞仅表达DHHC9,活化后其上调表达DH-HC18,而下调DHHC9的表达。结论 DHHCs家族成员在CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞中表达存在差异,活化后表达谱发生显著变化,提示DHHCs家族成员的表达与CD4+T细胞的活化有关,可能参与CD4+T细胞不同亚群活化的调控。

MicroRNA-7基因敲减小鼠模型的鉴定

目的鉴定miR-7基因敲减小鼠模型,为进一步研究miR-7的生物学功能奠定基础。方法常规剪取7只miR-7基因敲减(miR-7 knock down,miR-7KD)小鼠的脚趾和尾巴,分别用来提取基因组DNA和总RNA;剪取1只WT(wild-type,WT)小鼠的尾巴,提取其总RNA;将提取的两组小鼠的总RNA逆转录成c DNA;分别以基因组DNA和c DNA为模板,用特异性引物PCR技术扩增目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)片段;提取WT和miR-7KD小鼠7个不同组织器官的总RNA,利用Real-time PCR探针法检测各组织器官中miR-7成熟体的表达水平;HE染色观察miR-7KD小鼠心脏、肺脏以及结肠的形态学结构改变。结果 PCR结果显示,模型小鼠的脚趾基因组DNA和尾巴c DNA中均能扩增出载体目的基因EGFP片段;Real-time PCR结果显示,miR-7KD小鼠心脏、肝脏和脾脏等组织器官miR-7成熟体的表达水平较WT小鼠均显著下调(P<0.05);HE染色结果显示,miR-7KD小鼠心脏、肺脏以及结肠形态学结构发生了明显的病理性改变。结论成功鉴定了miR-7基因敲减小鼠模型,为后续深入探讨该分子的生物学功能提供重要实验基础。

微小RNA-7过表达对人肺癌细胞体内外转移的影响

目的探讨过表达miR-7对人肺癌细胞体内外转移的影响。方法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(命名为p-miR-7)体外瞬时转染人肺癌95D细胞后,划痕法检测细胞的体外迁移情况;侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变;建立人肺癌裸鼠体内转移模型,HE染色观察过表达miR-7对肺部肿瘤转移的影响;免疫荧光技术检测肿瘤转移相关蛋白Sema4C蛋白的表达。结果过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力(P<0.05);与对照组相比,过表达miR-7组未观察到明显的肺部肿瘤细胞转移灶(P<0.05);免疫荧光结果显示,过表达miR-7组中,肿瘤细胞内Sema4C蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞体外及体内的转移能力,提示miR-7有望成为肺癌后续基因治疗的新靶点。