液氮冷冻兔股骨头坏死模型制备新方法及可靠性评价

目的建立一种可靠的并可用于治疗和研究新的液氮冷冻法制成的兔股骨头坏死动物模型。方法采用成年新西兰大白兔21只,无菌条件下手术分离臀肌,切断股骨头圆韧带,显露股骨头。用医用棉签蘸取液氮,对股骨头进行3次冷冻3次复温,制备兔双侧股骨头坏死模型。于术后3、7d及2、4、6、8周进行X线摄片,股骨头大体形态和组织病理学观察。结果 X线摄片结果显示,制模2周时股骨头密度增高;4周时出现密度不均影像;6周时外形出现不规则变化,边缘有透亮区;8周时开始塌陷,关节间隙增大,骺板模糊。股骨头大体形态随时间推移,其受损程度呈加重演变特点。制模3 d的股骨头组织切片可见软骨细胞和骨细胞坏死;2周见骨小梁断裂、排列紊乱;4周见髓腔脂肪细胞坏死,内有新生血管及增生纤维组织;6周时出现匍行附着;而8周可见新骨沉积性生长,骺板处细胞挤压、变形。结论本实验中建立的液氮冷冻股骨头坏死模型新方法具有创伤性小、贴近人股骨头坏死病理演变规律的优点,为干细胞移植等治疗和研究提供了一种新的模型制备方法。

高强度聚焦超声制备兔股骨头坏死模型的可行性研究

目的： 探讨高强度聚焦超声新方法制备兔股骨头坏死模型的可行性。方法： 采用JC200型聚焦超声治疗系统，以80w/cm2强度超声照射家兔双侧股骨头，分别于照射后1、7、14、21d取材，结合股骨头大体形态和组织石蜡切片HE染色观察股骨头坏死情况。结果： 股骨头外观7d时可见界限明显的白色坏死区，表面光泽度稍下降；14d时坏死区表面软骨变黄、皱缩；21d时囊化、易剥脱。镜下见1d时坏死区表面软骨可见少量软骨细胞核溶解，髓质可见小静脉扩张充血、血窦充血；7d时坏死区表面软骨轻微挤压皱缩，软骨下区见骨小梁断裂和空骨陷窝，髓质造血组织明显减少，骨小梁表面成骨细胞消失，坏死骨小梁附近增生纤维组织，出现脂肪小囊，骺板稍变形；14d时兔股骨头表面软骨变薄，偶可见破损，坏死软骨细胞增多，表面破损程度、骺板变形程度较7d时加重，修复区可见增生肉芽组织和新生血管，有纤维组织附着于坏死骨小梁；21d时，股骨头表面软骨破损严重，骺板进一步扭曲变形，坏死区骨小梁破碎、消失，修复区可见纤维组织包绕坏死骨小梁和新生骨小梁。结论： 高强度聚焦超声制备的兔股骨头坏死模型效果稳定，具有清晰的病理演变特征，可作为一种制备股骨头坏死模型的新方法。

确证家兔外周血中存在具有多向分化能力的间充质干细胞

本研究确证家兔外周血中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞(MSC)。取成年新西兰大白兔,经每日皮下注射粒细胞集落刺激因子30μg/kg动员6 d后采集外周血样品,用Ficoll密度梯度离心和贴壁培养法分离纯化外周血间充质干细胞(PBMSC),镜下观察其生长形态并绘制增殖曲线;流式细胞术分析其表型特征;并分别对培养的PBMSC进行成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化能力鉴定。结果表明:①原代培养24 h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3-4 d后出现集落样生长,传代培养的PBMSC形态均一、呈长梭形漩涡状生长;②PBMSC增殖能力旺盛,培养2 d后进入对数生长期,细胞倍增时间为37.4 h;③流式细胞术检测显示,培养的PBMSC高表达CD29,不表达CD14;④PBMSC经成骨诱导培养21 d后,茜素红染色显示有明显的钙结节形成;经微团无血清软骨培养体系诱导培养21 d后,细胞团切片,阿利新蓝染色呈强阳性反应;经成脂诱导培养21 d后,油红染色显示诱导细胞胞浆内有大量脂滴。结论:成功从兔外周血中分离培养了PBMSC,在适宜诱导培养条件下具有向成骨、成软骨、成脂分化的能力。

大鼠外周血间充质干细胞的富集及生物学特性研究

目的:探究大鼠外周血间充质干细胞(PBMSC)的有效富集方法,并进一步研究其生物学特性。方法:采集经G-CSF动员的4周龄SD大鼠外周血,用密度梯度离心法分离出单个核细胞,继而采用贴壁培养法获得成纤维样集落生长细胞,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞术(CD90、CD44、CD29、CD45、CD11b和CD79a)和免疫细胞化学染色法(CD73、CD105、CD34和HLA-DR)分析富集的第2代PBMSC的表型特征,并对其进行成骨、成软骨和成脂肪细胞诱导分化能力鉴定。结果:1原代培养6-7 d可见明显的成纤维样细胞集落生长,至培养21 d细胞生长汇合度可达80%;传代细胞贴壁能力强,形态均一,呈梭形漩涡状生长;传代培养的PBMSC于培养次日即可进入对数生长期,细胞倍增时间为39.2 h。2富集的PBMSC高表达CD90、CD44、CD29、CD73及CD105,不表达CD45、CD11b、CD79a、CD34和HLA-DR。3PBMSC分别经成骨、成软骨和成脂细胞诱导分化培养21 d后,再分别经茜素红染色显示有大量钙化结节形成,阿利新蓝染色的胞浆内有大量糖胺聚糖形成,油红O染色细胞内有大量脂滴形成。结论:采用本研究方法可从大鼠外周血中分离富集到高纯度、高丰度的PBMSC,且其具备MSC的生长特点和表型特征,并具有中胚层多系分化能力。