硕士研究生分子生物学实验技术教学改革初探

为提高硕士研究生分子生物学实验技术的教学质量,在教学内容的选择、教学方法的改进、实验设施的分配与利用、考核体制的建立等方面进行改革,取得了较好效果,为研究生今后的科学研究和实际应用奠定基础。

蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病模型的体内外作用研究

目的初步探讨蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的阿尔茨海默病(AD)模型的体内外干预作用。方法侧脑室注射Aβ_(25-35)构建AD小鼠模型。连续5 d腹腔注射0.2 mg/kg蜂毒明肽。小鼠跳台测试认知功能,免疫组化检测海马CA1区Aβ_(1-42)表达。10μmol/L Aβ_(25-35)诱导海马神经元构建细胞损伤模型。100 nmol/L蜂毒明肽干预24 h后,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342染色检测细胞凋亡率,全细胞膜片钳技术检测海马神经元小电导钙激活性钾通道介导的中间后超极化电流(I_(mAHP))。结果动物实验显示,与模型组比较,蜂毒明肽组小鼠学习成绩错误次数减少,潜伏期延长、记忆成绩错误次数减少,Aβ_(1-42)表达减低(P<0.05)。细胞实验显示,蜂毒明肽组较模型组海马神经元存活率增加,凋亡率下降,I_(mAHP)减小(P<0.05)。结论蜂毒明肽对Aβ_(25-35)诱导的AD模型具有保护作用,其机制可能与减少Aβ表达,降低I_(mAHP)有关。

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响。结果经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒。重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞。结论成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量。

柚子皮精油提取及其驱蚊效果研究

本文通过响应面法研究了柚子皮精油的提取工艺,并初步考察了所提取精油的驱蚊效果。柚子皮精油提取采用微波辅助蒸馏法,在采用单因素实验考察蒸馏时间、料液比和NaCl质量分数对精油提取率的影响之后,通过响应面法进行提取工艺优化,以获得最佳提取方案;然后采用趋避法验证柚子皮精油的驱蚊活性。结果表明,最佳柚子皮精油提取方案如下:蒸馏时间100 min,料液比0.3∶2(g/m L),NaCl的质量分数1%,采用该方案柚子皮精油提取率达1.65%。通过初步驱蚊实验发现柚子皮精油具有较好的驱蚊活性,和市售六神花露水效果相当,驱蚊效应具有进一步深入研究的价值。

Ezrin增强子敲除可抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖和迁移

目的:探讨ezrin增强子敲除对食管癌Eca-109细胞ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法:将靶向ezrin增强子上、下游的CRISPR/Cas9重组质粒共转染食管癌Eca-109细胞,经嘌呤霉素筛选,获得敲除ezrin增强子的细胞株Eca-C2。用qPCR和Western blotting分别检测敲除ezrin增强子的Eca-C2细胞中ezrin mRNA和蛋白的表达,用蛋白芯片技术检测MAPK通路相关蛋白的表达,用WST-1法和细胞划痕愈合实验分别检测ezrin增强子敲除对Eca-C2细胞增殖和迁移能力的影响。结果:成功构建稳定敲除ezrin增强子的食管癌细胞株Eca-C2;与对照细胞相比,ezrin增强子敲除细胞ezrin mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(均P<0.05)。Eca-C2细胞中17种被检测的MAPK通路相关蛋白中有9种(AKT、CREB、GSK3b、MKK6、m TOR、P38、P53、P70S6K和RSK1)表达下调,ezrin增强子敲除后细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制(均P<0.05)。结论:在人食管癌Eca-109细胞中,敲除ezrin增强子可明显抑制细胞的增殖和迁移。

几种肿瘤细胞中ezrin基因增强子区转录调控特性的研究

该文采用Western blot技术检测人食管癌EC109细胞、鼻咽癌CNE2细胞和宫颈癌HeLa细胞中Ezrin蛋白的表达;采用DNA片段定向克隆技术构建一系列携带ezrin基因增强子区–1541/–706序列的报告基因表达载体,将载体瞬时转染EC109、CNE2和HeLa细胞,检测荧光素酶活性;研究肿瘤细胞中ezrin基因增强子区的转录调控特性。实验结果显示,在被检测的三种肿瘤细胞中,Ezrin蛋白的表达水平没有明显不同。EC109细胞中,当ezrin基因–1541/–706片段正向位于无启动子的报告基因上游时,表现出类似启动子的转录激活作用;当这一片段反向连接时转录激活作用几乎消失。当–1541/–706片段正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著增强荧光素酶表达;然而,当这一片段反向位于启动子上游以及正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。ezrin基因–1541/–706片段在CNE2和HeLa细胞中的转录调控作用,与其在EC109细胞中的转录调控作用部分相似,但不完全相同。结果表明,ezrin基因增强子区具有转录激活和转录增强双重作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性以及细胞特异性。

短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应

目的研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因的干扰效应。方法针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(shRNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组(阴性对照组)及不加任何重组表达载体的空白对照(空白对照组)。重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度。结果荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平(P均<0.01);对UL54基因的抑制率在阴性对照组(加shRNA NC)、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7%、69%、56%及55%,以shRNA1081组为最高。终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降(P均<0.01)。结论成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。