人白介素-12植物表达载体的构建

目的构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI,SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的:构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。方法:以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1 770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。结果:经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68 860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。结论:成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。

人白介素12亚基p40和p35基因串联在毕赤酵母中的表达及表达产物活性分析

利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12(hscIL-12),PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导,hscIL-12在酵母中获得分泌表达,表达产物经Western blot检测,显示该蛋白相对分子质量为70kDa,可与鼠抗人IL-12单克隆抗体特异性结合;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中hscIL-12约占总蛋白的26%,表达量约为60mg/L;生物学活性实验表明,重组蛋白能促进人外周血淋巴细胞增殖。为利用rhscIL-12进行基因治疗奠定了基础。

双shRNA表达载体对HSV-2复制的干扰作用

目的利用带有多个启动子的质粒p Genesil10-3p,构建针对HSV-2靶基因UL27和UL54的双短发卡RNA(Duo-shRNA)表达载体,探讨双shRNA表达载体对双靶基因的干扰作用以及对HSV-2病毒增殖的影响。方法 DuoshRNA通过脂质体转染HEK293细胞后接种HSV-2,采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,终点滴定法检测细胞上清液中病毒滴度,QPCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测对靶基因mRNA的抑制率,蛋白质印迹(Western blot,WB)检测靶蛋白的表达量。结果结果表明Duo-shRNA对于细胞存活率、抑制HSV-2复制以及干扰靶基因表达方面都优于单-shRNA,可以达到多个单基因-shRNA联合作用的干扰效果。结论利用双启动子的方法构建了针对HSV-2的UL27和UL54的shRNA质粒表达载体,更好的抑制HSV-2病毒靶基因mRNA表达水平以及病毒在HEK293细胞中增殖,实现了多个单基因的shRNA干扰效应的相互作用。