抑制Rab25基因表达的人NSCLC厄洛替尼耐药细胞PC9/ER的建立

目的 Rab25在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)等多种肿瘤中过度表达,提示其可能在NSCLC的发生发展及耐药形成中发挥重要作用。为进一步探讨Rab25的功能及其在NSCLC酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐药形成中的作用,建立稳定慢病毒介导的shRNA靶向干扰Rab25基因人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞PC9/ER稳定株。方法实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测PC9/ER及PC9细胞中Rab25基因mRNA的相对表达情况。筛选出Rab25基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA并构建GV248-shRNA-Rab25慢病毒载体,酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染PC9/ER细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株。RT-PCR鉴定PC9/ER的表达,CCK-8检测对厄洛替尼的敏感性。结果 PC9/ER细胞中Rab25基因的mRNA表达水平显著高于PC9细胞。构建的重组慢病毒质粒经测序鉴定正确。RT-PCR证实,干扰Rab25后,PC9/ER细胞株中Rab25表达水平明显降低,抑制率为88.3%。通过传代10次后,PC9ER-Rab25i稳定细胞株中Rab25基因的mRNA表达水平显著低于阴性对照组,P<0.05。PC9ERRab25i稳定细胞株的IC_(50)为(2.133±0.222)μmol/L,显著低于阴性对照组的(6.375±0.799)μmol/L,P=0.007。结论成功构建了Rab25-shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制Rab25基因表达的人NSCLC厄洛替尼耐药细胞PC9/ER,初步验证Rab25基因能够改善肺癌EGFR-TKIs获得性耐药,为进一步研究Rab25在NSCLCEGFR-TKIs获得性耐药的机制及逆转其获得性耐药提供了可靠的细胞模型。