柯萨奇病毒A组5型实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的建立柯萨奇病毒A组5型(CVA5)特异的一步法实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)核酸检测方法。方法以流行于遵义地区的CVA5病毒株和NCBI基因库中随机下载的CVA5 VP1基因序列作为参考序列,分析这些序列的保守区域,在其保守区设计特异性的引物与Taqman探针,建立检测CVA5的一步法实时荧光RT-PCR。通过构建含CVA5 VP1保守区域的重组质粒,绘制标准曲线,并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性及临床样本检出限进行评价。利用该方法对遵义地区273份未明确分型的肠道病毒阳性样本进行检测,将检出的部分CVA5阳性产物进行测序。结果成功建立一种基于实时荧光RT-PCR的CVA5检测方法,该方法在10^(4)~10^(9)copy/mL范围内具有良好的线性关系(R 2>0.999),平均扩增效率为102.26%。灵敏度高,对临床样本的检出限为103copy/mL。该方法的特异性强,与柯萨奇病毒A组2型(CVA2)、柯萨奇病毒A组4型(CVA4)、柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒等均不发生交叉反应。重复性实验的变异系数低于1.5%。273份未明确分型肠道病毒阳性样本中共检出25份CVA5,占未明确分型阳性样本的9.16%。结论该研究建立的一步法CVA5RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于CVA5的检测。

抑制血清素转运蛋白表达联合Erastin诱导肠癌细胞铁死亡的实验研究

目的观察肠癌SW480细胞经铁死亡诱导剂Erastin处理后血清素转运蛋白(serotonin transporter,SERT)表达的变化,探索调控SERT表达联合Erastin对肠癌细胞铁死亡的影响。方法Erastin处理肠癌SW480细胞,CCK8检测细胞的存活能力,Western blot评估细胞内血清素转运蛋白SERT及铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4和ACSL4的影响,流式细胞术分析癌细胞内ROS含量的变化。同时利用siRNA干扰下调细胞内SERT表达,观察调节SERT表达联合Erastin对癌细胞铁死亡的影响。结果10μmol/L Erastin处理肠癌SW480细胞可诱导癌细胞发生铁死亡,并显著上调细胞中SERT表达。siSERT后Erastin所致的癌细胞中铁死亡抵抗蛋白SLC7A11和GPX4下降更为显著,而铁死亡执行蛋白ACSL4则明显升高。5⁃HT刺激不仅逆转Erastin对SW480细胞所致的SLC7A11和GPX4减少及铁死亡作用,同时还使得Erastin联合siSERT对铁死亡的协同作用得到一定程度的抑制。结论Erastin刺激在诱导肠癌SW480细胞发生铁死亡的同时,代偿性上调了SERT的表达;抑制SERT表达可增加肠癌细胞对Erastin的铁死亡敏感性。

后外侧微创入路行全髋关节置换术治疗老年股骨颈骨折的早期疗效

目的分析后外侧微创入路行全髋关节置换术治疗老年股骨颈骨折的方法、效果及骨代谢、血液流变学变化。方法根据随机数表法,将2019年1月至2021年7月在本院行全髋关节置换术治疗的98例老年股骨颈骨折患者分为观察组和对照组,每组各49例。对照组采用后外侧常规入路,观察组采用后外侧微创入路。比较两组患者临床指标、疼痛程度和髋关节功能、骨代谢指标、血液流变学指标、平衡功能以及并发症发生率。结果相比对照组,观察组切口较小,术中出血量较少,术后首次下床时间以及住院时间均较短(P<0.05);治疗后相比对照组,观察组疼痛程度较低,髋关节功能较好(P<0.05);治疗后观察组骨代谢改善情况、血液流变学各项指标改善情况均比对照组较好(P<0.05);治疗后观察组平衡功能相比对照组较高(P<0.05);两组并发症发生率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论经后外侧微创入路行全髋关节置换术治疗老年股骨颈骨折,效果显著,可有效缓解患者痛苦,改善骨代谢,促进血液循环,利于髋关节功能的恢复,减轻机体平衡功能障碍。

PCR-荧光探针法检测婴幼儿和儿童人鼻病毒的初步评估

目的通过PCR-荧光探针法和Sanger测序法检测呼吸道感染婴幼儿和儿童人鼻病毒(HRV)的感染情况,以评估PCR-荧光探针法的病毒检测能力,并分析HRV载量对患儿临床指标的影响。方法收集2019年5—7月在遵义医科大学第三附属医院住院收治的具有呼吸道感染症状的175例患儿的鼻咽拭子标本,采用PCR-荧光探针法和Sanger测序法检测HRV感染情况并分析HRV载量对婴幼儿和儿童临床指标的影响。结果PCR-荧光探针法检出阳性标本51份(51/175,29.14%),阴性标本124份(124/175,70.86%)。Sanger测序法检出阳性标本48份(48/175,27.43%),阴性标本127份(127/175,72.57%)。与Sanger测序法相比,PCR-荧光探针法检测HRV的灵敏度和特异度分别为100.00%和97.64%,阳性预测值和阴性预测值分别为94.12%和100.00%,一致率为95.80%。两种方法对HRV的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高载量病毒组和低载量病毒组住院天数、入院前最高体温、发热天数、白细胞计数、淋巴细胞百分比及降钙素原比较,差异均无统计学意义(P>0.05),超敏C反应蛋白比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCR-荧光探针法检测HRV灵敏度高、特异度高、检测周期短、费用较低且操作简便快捷,可在临床检测HRV中广泛推广。此外,高载量HRV的婴幼儿和儿童的超敏C反应蛋白水平较低载量HRV的婴幼儿和儿童更高。

969例呼吸道感染儿童中人博卡病毒的感染情况与临床特征分析

目的了解遵义地区儿童急性呼吸道感染中人博卡病毒(HBoV)的感染情况,为儿童呼吸道感染的临床诊疗提供参考。方法收集2019年5月至7月遵义市第一人民医院急性呼吸道感染儿童鼻咽拭子标本969例,采用PCR-荧光探针法检测HBoV核酸,对PCR产物进行Sanger法测序,并收集感染患儿临床资料进行临床特征分析。结果在969例鼻咽拭子标本中,共检出45例阳性标本,阳性率为4.6%。其中男性患儿多于女性,两者检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05);阳性病例主要集中在36月以内患儿(77.7%),不同年龄段检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同年龄段阳性患儿的临床特征有所差异,其中各年龄段出现发热、扁桃体肿大、CRP增高的比例比较,差异有统计学意义(P<0.05);阳性患儿的临床诊断以社区获得性肺炎最多见(51.1%);单纯HBoV感染率为37.8%,混合感染比例高达62.2%。结论HBoV是2019年5至7月遵义地区儿童急性呼吸道感染的重要病原体,及时准确的检测和分析HBoV感染,对临床诊疗具有重要意义。

埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用

目的克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c(Aael-yellow-c)基因,并探讨rAael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因,纯化后的片段与pEASY-E1载体连接,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度rAael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度rAael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶时间(TT)的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1287 bp,含27个氨基酸组成的信号肽,成熟肽序列长1200 bp,编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c基因片段,大小约为1200 bp。菌液PCR、双酶切和测序鉴定显示,pEASYE1-Aael-yellow-c质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体形式表达;镍柱亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带。Western blotting结果显示,该蛋白可被His-tag抗体和抗rAael-yellow-c蛋白的兔血清多克隆抗体识别。血小板聚集抑制实验结果显示,2083.30、416.66、83.33、16.67和3.33 nmol/L rAael-yellow-c蛋白可抑制由ADP诱导的血小板聚集,差异具有统计学意义(t=7.09、10.39、5.39、10.54和8.93,P<0.01),其中3.33 nmol/L的重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集抑制作用最强,抑制率为(59.27±11.90)%;0.67、0.13和0.02 nmol/L的重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集作用无影响(t=2.10、1.33和0.00,P>0.05)。内外源凝血实验结果显示,与阴性对照组相比,0.12、1.20和12.00μmol/L rAael-yellow-c分别作用于人血浆时,PT分别为13.63~14.10、13.32~14.38和13.55~16.01 s,差异无统计学意义(t=1.33、0.63和1.00,P>0.05);APTT分别为32.76~38.46、31.94~41.78和33.34~39.29 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.06和0.24,P>0.05);TT分别为19.12~21.20、19.7~23.12和21.85~25.30 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.24和1.60,P>0.05)。结论获得的r Aael-yellow-c蛋白主要通过抑制ADP诱导的血小板聚集作用帮助蚊虫吸血。