基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TLc)分别对目的蛋白进行酶切反应。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化。酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值。结果设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒。表达并纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白,命名为CYVAMP。利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2~32μmol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65~110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适。CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右。酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16±0.28)s-1。TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1。结论成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需。