新棘衣棘头虫形态特征及其感染黄鳝的肠道组织病理变化

【目的】了解新棘衣棘头虫(Pallisentis celatus)对黄鳝(Monopterus allbus)的寄生机制,为防治该寄生虫病提供参考。【方法】采用扫描电镜与石蜡组织切片技术对新棘衣棘头虫的形态特征及其感染黄鳝的肠道组织进行观察研究。【结果】新棘衣棘头虫吻突较小,吻钩呈牛角状,表面光滑无痕,基部粗大,尖部指向体部后方;新棘衣棘头虫的体壁由角质层、表皮层和肌肉层组成,中央没有消化道。新棘衣棘头虫对黄鳝肠道的机械挤压作用非常明显,寄生部位的黏膜层、黏膜下层及部分肌肉层消失;同时新棘衣棘头虫也受黄鳝肠道挤压,与黄鳝肠道黏膜接触段严重变形,部分虫体表面与黄鳝肠道黏膜紧密接触,难以区分。【结论】新棘衣棘头虫对黄鳝肠道的初期感染,吻突的吻钩起重要固定作用,随着虫体的生长,其局部体表与黄鳝肠道组织融为一体,吻突失去实际作用而缩回棘头虫体腔内。

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为Bg TPS1(Gen Bank登录号:KR050213)和Bg TPS2(Gen Bank登录号:KR050214)。其中,Bg TPS1基因c DNA序列全长2 987 bp,开放阅读框(ORF)2 502 bp,编码833个氨基酸;Bg TPS2基因c DNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。Bg TPS1和Bg TPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且Bg TPS2基因的表达量为Bg TPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,Bg TPS1和Bg TPS2基因mRNA均上调表达。其中,Bg TPS2的表达量始终显著高于Bg TPS1。在0℃时,Bg TPS1和Bg TPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且Bg TPS2基因的表达量显著高于Bg TPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。

褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析

为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens(St錶)酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1(GenBank No.:ALE32751)和NlPPO2(GenBank No.:ALE32752)全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。

黄颡鱼免疫球蛋白3型轻链基因cDNA及其表达分析

应用同源克隆和RACE-PCR方法获得黄颡鱼免疫球蛋白3型轻链(IgL3)基因全长cDNA,并分析了该基因在组织中的表达。黄颡鱼IgL 3的cDNA全长为965bp,包含5′53bp非编码区,3′189bp非编码区,开放阅读框723bp,编码241个氨基酸。黄颡鱼与其他6种硬骨鱼类IgL 3氨基酸序列比对分析表明,黄颡鱼IgL 3氨基酸序列与大鳍鱯IgL 3型的相似性最高,为72.8%,与大西洋鲑IgL 3型的相似性最低,为42.2%。进化树分析表明,黄颡鱼IgL与大鳍鱯IgL 3型聚为一支同时与其他鱼类IgL 3型聚为一簇,明显与L1和L2进化支不同。实时PCR显示,黄颡鱼IgL3基因主要在头肾、脾脏、血细胞、鳃和肠中转录表达;注射嗜水气单胞菌后,头肾、脾脏和血细胞IgL3基因表达量有显著上升。表明这些组织是黄颡鱼IgL 3型基因主要的表达器官,在免疫反应具有重要作用。