入侵贵州贵阳草地贪夜蛾的分子鉴定及适应性研究

【目的】贵州省为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的周年繁殖区,采用分子标记鉴定贵州贵阳草地贪夜蛾的种群生物型,并对其在玉米、高粱、水稻上的适应性进行研究,以明确入侵贵州贵阳的草地贪夜蛾的种群生物型并了解其特性。【方法】采用COⅠ和Tpi两种分子标记,对贵州贵阳3个县市共32个草地贪夜蛾样本进行PCR扩增、测序和比对分析,明确入侵贵州贵阳的种群生物型。记录草地贪夜蛾各龄期幼虫取食3种寄主植物(玉米、高粱、水稻)后的发育历期、成虫羽化率和存活时长,评估草地贪夜蛾对3种寄主植物的适应性。【结果】基于线粒体COⅠ基因分析结果显示,32个草地贪夜蛾样本中,93.75%为水稻型、6.25%为玉米型,且其序列特征与相应生物型的草地贪夜蛾种群具有较高的一致性;而基于核基因组Tpi基因分析的结果表明,32个样本的单倍型特点均表现为玉米型。适应性研究结果显示,入侵贵阳的草地贪夜蛾在玉米上的幼虫期最短(13.22 d)、成虫存活时间最长(16.42 d)、羽化率最高(95.14%),在高粱上次之,在水稻上的幼虫期最长(16.59 d)、成虫存活时间最短(8.56 d)、羽化率最低(75.15%)。【结论】利用COⅠ分子标记方法鉴定入侵贵州贵阳的草地贪夜蛾种群生物型时,93.75%为水稻型、6.25%为玉米型,而利用Tpi分子标记的结果为100%玉米型。以玉米为食的雌性草地贪夜蛾寿命明显高于以水稻、高粱为食的雌性草地贪夜蛾。研究结果有助于分析入侵贵州省的草地贪夜蛾来源,可为高粱的草地贪夜蛾防控提供一定的基础。

白背飞虱海藻糖合成酶基因调控几丁质合成的功能

【背景】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】本研究通过抑制白背飞虱(Sogatella furcifera)TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS(SfTPS1和SfTPS2)与GFP的双链RNA(dsRNA)后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

【目的】酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱(Sogatella furcifera)3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2079、999、2070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱(Nilaparvata lugens)的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌诱导24 h后,SfPPO1、SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量均显著升高。【结论】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的表达存在组织和龄期特异性,且在不同菌诱导情况下存在免疫应答差异性。研究结果有助于更加全面、深入地探索白背飞虱酚氧化酶在调控昆虫发育及免疫中的潜在分子机理。