生物转化法制备稀有人参皂苷Rh_2

人参是最著名的中草药之一,其活性成分中含有具有抗肿瘤活性的人参皂苷Rh_2,但天然人参中Rh_2的含量不到十万分之一,十分稀少。本文以人参皂苷Rg_3为底物,加入来源于Terrabacter ginsenosidimutans的葡萄糖苷酶进行催化反应生成人参皂苷Rh_2,并对催化反应体系进行优化研究,确定了最佳反应条件:催化反应的温度40℃,pH值为7.0-8.0。本方法生产人参皂苷Rh_2工艺简单,反应选择性高,副产物少,生产成本和产品质量优于化学法,适合工业化生产。

糖苷酶在人参皂苷转化中的应用

人参皂苷是人参中的主要活性成分。人参皂苷中含量较高的主要成分如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1和Re均是在人参皂苷的苷元原人参二醇(APPD)或苷元原人参三醇(APPT)上加上不同数量的葡萄糖基、阿拉伯糖基、木糖基或鼠李糖基等糖基形成的。这些主要人参皂苷脱去部分或全部的糖基的产物具有更强的生物活性及更好的人体吸收率。去除糖基的产物如Rg3、Rh2、化合物K(C-K)、F2、Rh1、Rg1、APPD、APPT在天然人参中不存在或含量极低,因此也被称为稀有人参皂苷。稀有人参皂苷可以通过糖苷酶水解主要人参皂苷获得。已报道的具备人参皂苷水解活力的糖苷酶有β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶及β-木糖苷酶。我们简要综述近5年来糖苷酶用于制备稀有人参皂苷的研究进展。

食品用酶毕赤酵母表达载体的构建

目的:构建可用于表达食品用酶的毕赤酵母表达载体pMA,该载体不含非GRAS认证来源的DNA片段。方法:以pPIC9K为模板,通过重叠延伸PCR方法,将来源于大肠杆菌的Amp R抗性标记和复制区ori插入AOX1启动子的SacⅠ位点,最终线性化载体时可用SacⅠ将该来源于大肠杆菌的片段切除。为了避免使用G418等抗性标记并减少载体大小,将原来的HIS4标记和G418标记删除,采用截短了启动子的ADE2标记来实现高拷贝整合。结果:构建获得载体pMA,用SacⅠ线性化后大小仅为3.6 kb;利用pMA表达了一种食品用β-半乳糖苷酶。结论:pMA可用于表达食品用酶,为酵母生产食品用酶奠定了基础。

稀有人参皂苷Rh_3及Rk_2的制备及结构确认

Rh_3和Rk_2有良好的抗肿瘤和免疫功效,但要简便制备高含量的Rh_3及Rk_2却相对困难。本文以人参皂苷Rg_3为底物,经葡萄糖苷酶催化水解后生成产物Rh_2,然后在酸性条件下,Rh_2进一步转化为两个未知化合物。反应液经前处理后,通过制备色谱纯化得到高纯度的两个未知化合物的混合物。通过质谱和核磁对未知物进行了结构确证,结果表明,两个未知化合物为Rh_3和Rk_2。

人参皂苷Rh2合成酶突变体的基因克隆与表达

通过分子克隆技术将来源于Terrabacter ginsenosidimutans的β-葡萄糖苷酶突变基因序列Rh2-015经过PCR扩增技术插入到表达载体p ET22b(+)上的Nde I和EcoR I位点,得到重组质粒p ET22b-Rh2-015。对获得的重组菌进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示其在56.7kDa处具有明显的蛋白质特异性条带,同时对分解人参皂苷Rg3生成人参皂苷Rh2具有较高转化率,为实现工业化酶法生产高含量人参皂苷Rh2奠定了基础。