浅谈设计性实验在临床检验基础实验教学中的应用

随着检验医学技术的不断进步与发展,常规的检验基础实验教学已无法满足教学需求。因此,需要在常规教学中引进先进的教学模式,采取正确的引导方式,以提高学生对学习的兴趣及热情,将科研发展方向与前沿内容相结合,通过丰富的教学手段,培养学生科研及创新思维。此次研究对设计性实验在临床检验基础实验教学中具体应用作简要阐述。

浅谈邵阳地区血友病患者的预防治疗

目的了解邵阳地区血友病患者的诊疗现状,加强对我市血友病患者的诊治工作,推广预防治疗,减少致残率。方法通过走访调查、电话调查及网络调查等形式,了解邵阳地区血友病患者的诊疗情况。结果我市血友病患者79例,预防治疗者3例(3. 8%),所有患者中关节功能障碍者65例(82. 27%)。结论邵阳地区血友病患者确诊率低,接受预防治疗极少,残疾率高。

EGCG调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对特应性皮炎大鼠Th1/Th2平衡的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对特应性皮炎(AD)大鼠的保护作用及潜在机制。方法 将SPF级SD大鼠分为对照(Control)组、AD模型(AD)组、AD+EGCG治疗(EGCG)组、AD+地塞米松阳性对照(DXM)组、AD+EGCG+TLR4激动剂(TLR4)组,每组18只。根据临床损伤严重程度计算皮肤损伤评分;ELISA检测炎症因子的表达;HE染色观察组织学变化;流式细胞仪分析Th1和Th2阳性细胞比例;Western blot检测TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白水平。结果 与Control组比较,AD组大鼠背部皮肤损伤程度较重,病理学损伤评分增加(P<0.05),白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及Th1细胞百分比降低,白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13)水平及Th2细胞百分比升高(P<0.05),TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平升高(均P<0.05)。与AD组比较,EGCG组和DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分降低,Th_1细胞百分比、IL-2、IFN-γ水平升高,IL-4、IL-13水平、Th_(2)阳性百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平下降(均P<0.05)。与EGCG组比较,DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分、Th_1、Th_(2)细胞百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平差异无统计学意义(均P>0.05),TLR4组大鼠皮损评分及皮肤损伤病理学评分升高,皮损组织中Th_1细胞百分比降低,Th_(2)阳性百分比及TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上调(均P<0.05)。结论 EGCG可以通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,维持Th1/Th2平衡来抑制炎症反应,进而降低AD的严重程度。

沙眼衣原体假定蛋白CT389原核表达质粒的构建及结构预测

目的构建能表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)假定蛋白CT389的质粒pGEX6P-ct389及预测其结构。方法设计特异性引物,以Ct基因组为模板,PCR法扩增ct389基因,构建携带目的基因的重组质粒pGEX6Pct389;通过PCR鉴定和双酶切鉴定初筛,测序鉴定验证结果;比较ct389和tc0668基因序列及其编码产物的相似性,采用生物信息学预测CT389蛋白的二级结构和三级结构。结果获得大小约为1 300 bp的ct389基因片段,并成功得到重组质粒pGEX6P-ct389。ct389和tc0668基因及其编码产物的相似性高达84%和92%,CT389蛋白α-螺旋、无规卷曲和β片层的含量分别为27.7%、49.26%和占23.04%。与其三级结构最接近的是鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物。结论Ct389与tc0668基因从DNA到编码产物具有较高的相似性,ct389可能是重要的沙眼衣原体毒力基因。

HAART对AIDS合并HBV/HCV感染患儿CD4^+T细胞、病毒载量的影响

目的探讨高效抗逆转录病毒治疗(HAART)对AIDS合并HBV/HCV感染患儿CD4^+T细胞、病毒载量和肝功能的影响。方法选取2014年4月至2015年4月在该院接受治疗的单纯HIV感染患儿88例,分为A组;HIV合并HBV感染的患儿8例,分为B组;然后将HIV合并HCV感染的23例患儿分为C组。3组患儿全部接受HAART治疗,治疗时间为两年,比较3组患儿治疗前后肝功能、病毒载量以及CD4^+T细胞变化情况。结果治疗前,3组肝功能异常的患儿共计29例(24.79%),3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,3组肝功能异常的患儿共计82例(70.09%),3组治疗前后比较差异有统计意义(P<0.05)。治疗前,3组患者的AIT、AST及TBIL水平比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,3组患儿的AIT、AST及TBIL水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);且A组的ALT水平明显低于B组和C组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组AST、TBIL水平比较无统计学意义(P>0.05)。治疗前,3组患儿的CD4^+T细胞及HIV RNA水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,3组患者的CD4^+T细胞水平均明显增高,HIV RNA水平均明显降低,,差异有统计学意义(P<0.05)。但3组患者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论高效抗逆转录病毒治疗AIDS合并HBV/HCV感染患儿,对患儿的肝功能存在不同差异,治疗后能明显升高CD4^+T细胞水平,降低病毒载量,对于AIDS合并HBV/HCV感染患儿均存在不同差异,在临床应用过程中应密切关注患儿的肝功能状况。

miRNA-222靶向Smad2/7对牙周膜干细胞向成骨分化的影响

目的:探讨miRNA-222靶向Smad2/7对牙周膜干细胞向成骨分化的影响。方法:采用流式细胞术鉴定人牙周膜干细胞表面标志物,采用油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色法验证成脂、成骨和软骨分化能力,同时验证miRNA-222、sh-Smad2和sh-Smad7对成骨分化的影响,RT-PCR检测miRNA-222在成骨分化中的表达,采用Western blot检测miRNA-222对ALP、Runx2、OCN、Smad2和Smad7蛋白的影响。结果:牙周膜干细胞表面呈阳性表达的有STRO1和CD146,阳性率分别为98.63%和99.16%。RT-PCR检测结果显示,在成骨分化过程中,人牙周膜干细胞中miRNA-222表达明显降低。茜素红染色结果显示,与空白组相比,miRNA-222模拟组中的红褐色矿化结节的数量明显降低(P<0.05),miRNA-222抑制组中的红褐色矿化结节的数量显著增多(P<0.05);与sh-NC相比,sh-Smad2组和sh-Smad7组红褐色矿化结节的数量显著减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与空白组相比,miRNA-222模拟组的ALP、Runx2、OCN蛋白表达明显降低(P<0.05),与miRNA-222模拟组相比,miRNA-222抑制组的ALP、Runx2、OCN蛋白表达显著升高(P<0.05);与空白组相比,miRNA-222模拟组的Smad2和Smad7蛋白表达明显降低(P<0.05),与miRNA-222模拟组相比,miRNA-222抑制组的Smad2和Smad7蛋白表达显著升高(P<0.001)。结论:过表达miRNA-222可以减少Smad2和Smad7表达,从而抑制人牙周膜干细胞的成骨分化。

腹透相关性腹膜炎患者万古霉素腹腔内给药后的血药浓度影响因素分析

目的监测腹透相关性腹膜炎(PDRP)患者万古霉素腹腔内给药后的血药浓度,并分析相关影响因素。方法选取2017年10月至2021年1月在邵阳学院附属第一医院行腹腔内给予万古霉素且监测血药浓度的45例PDRP患者进行分析,万古霉素腹腔内给药方案为体质量≤60 kg者1 g/次,体质量>60 kg者20 mg·kg^(-1)给药(每次剂量不超过2 g),给药后第3日采血监测血药浓度,根据血药浓度分为高血药浓度组(≥15μg·mL^(-1))及低血药浓度组(<15μg·mL^(-1)),比较两组一般资料及实验室指标,多因素Logistic回归分析影响万古霉素血药浓度的因素。结果45例接受万古霉素治疗且血药浓度监测者中高血药浓度者13例,低血药浓度者32例。万古霉素高血药浓度组患者少尿或无尿比例显著高于低血药浓度组(P<0.05),而每日腹透液交换次数则显著低于低血药浓度组(P<0.05)。Logistic回归分析发现,每日腹透液交换次数是影响万古霉素血药浓度的独立危险因素(P<0.05)。每日腹透液交换次数相同时,少尿或无尿患者万古霉素血药浓度值与尿量正常患者比较差异无统计学意义。随着每日腹透液交换次数的增加,尿量正常患者万古霉素血药浓度呈降低趋势(P<0.05)。结论PDRP腹腔内万古霉素给药后的血药浓度有个体差异,在优化患者万古霉素腹腔内给药时需考虑每日腹透液交换次数,当每日腹透液交换次数增加时,应适当增加万古霉素给药剂量或增加给药频率并加强监测,以便血药浓度达标。

弓形虫毒力因子ROP18研究进展

弓形虫是一种专性细胞内寄生物,能够感染包括人在内的哺乳动物和禽类中间宿主。弓形虫能分泌多种效应分子,这些效应分子能够作用宿主细胞并促进虫体的增殖。其中,棒状体蛋白18(ROP18)是一种寄生虫毒力衍生因子,是弓形虫毒性的决定性因子之一。在感染过程中,ROP18被分泌到宿主细胞质中,最终定位到细胞膜上。ROP18是一种苏氨酸激酶,但是介导其病理效应的分子机制尚不清楚,本文对弓形虫关键毒力因子ROP18的研究进展做一综述。

未成年发热患者流感病毒感染的风险预测模型的建立与验证

目的分析未成年发热患者发生甲型流感病毒(influenza A virus,INFA)感染的独立危险因素,构建简单、有效的临床预测模型,以预测患者发生INFA感染的风险。方法选取2022年6月13日至7月5日于邵阳学院附属第一医院发热门诊就诊的未成年患者1001例,收集患者的基本资料、血常规、超敏C反应蛋白和鼻咽拭子流感病毒抗原检测结果。首先通过Lasso回归筛选预测因子,然后进行多因素Logistic回归,建立未成年发热患者发生INFA感染的风险预测模型,并用列线图展示模型。采用ROC曲线和校准曲线评价预测模型的区分度和校准度;使用决策曲线分析(DCA)评估预测模型的临床有效性。采用Boot-strap法重抽样1000次,对模型进行内部验证。结果年龄、红细胞压积(HCT)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、淋巴细胞数(Lym#)和中性粒细胞数(Neut#)是未成年发热患者发生INFA感染的风险预测因子。依据预测因子绘制列线图,构建临床预测模型。列线图模型的ROC曲线下面积(AUC ROC)为0.728(0.697~0.759),敏感性为71.89%,特异性为64.39%,约登指数为0.363,内部验证C-指数为0.720。结论构建的临床预测模型较好,可以为临床医生初步识别INFA感染提供依据。

沙眼衣原体Ahpc蛋白的原核表达、纯化及活性分析

本研究根据Ct Ahpc基因序列设计特异性引物,以Ct DNA为模版PCR扩增Ahpc基因到大小为585 bp,将其连接到p ET28a获得重组质粒p ET28a-Ahpc,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL/p ET28a-Ahpc,利用IPTG诱导重组Ahpc蛋白表达,目的蛋白分子量大小约为26 k D。利用Ni-NAT亲和层析法纯化得到的重组Ahpc蛋白。氧化铁二甲酚橙法检测发现Ahpc蛋白能够分解双氧水和叔丁基过氧化氢,具有分解过氧化合物的活性。测定重组大肠杆菌在百草枯所致氧化胁迫下的生长曲线,发现表达Ahpc蛋白的重组菌的生长情况比对照好。本研究成功表达和纯化得到沙眼衣原体Ahpc蛋白并测定其活性,为解析沙眼衣原体的抗氧化机制提供实验证据。

弓形虫pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18质粒构建及对RAW264.7细胞凋亡影响研究

目的构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,体外研究弓形虫ROP18蛋白是否具有抑制H2O2诱导RAW264.7细胞凋亡的作用。方法通过PCR扩增ROP18基因,构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,转染RAW264.7细胞,为重组质粒组;并设置未含POP18基因的空白质粒为对照组。分别检测重组质粒组与对照组线粒体及细胞质中细胞色素c含量。结果成功构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18重组质粒,通过双酶切鉴定,得到2个符合预期大小的条带。使用H2O2分别诱导重组质粒组与对照组对RAW264.7细胞的凋亡作用,分别检测线粒体及细胞质中细胞色素c含量,发现两组细胞色素c含量水平无区别。结论ROP18没有抑制H2O2经线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡,为进一步探索ROP18蛋白功能及弓形虫病的发病机制提供了理论依据。

梅毒螺旋体TrkA蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 分析梅毒螺旋体钾离子转运蛋白TrkA的生物学特性,表达、纯化并制备TrkA蛋白的抗血清。方法 从NCBI中查到梅毒螺旋体钾离子转运蛋白TrkA的氨基酸序列,采用生物信息学方法分析TrkA蛋白的基本理化性质、信号肽、定位、跨膜区、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构和B细胞表位。按照梅毒螺旋体TrkA的DNA序列设计引物,PCR扩增TrkA基因,双酶切后与质粒pET28a相连,连接产物pET28a-TrkA转转化入大肠埃希菌BL21,培养后使用IPTG诱导重组TrkA蛋白表达,利用Ni^(2+)亲和层析法纯化TrkA蛋白。取TrkA蛋白皮下接种小鼠,免疫3次,制备小鼠血清,ELISA法检测血清TrkA特异性IgG滴度。结果 生物信息学预测TrkA蛋白共有236个氨基酸,相对分子质量26.7ku,为胞内蛋白。该蛋白二级结构中α螺旋占45.34%,β折叠占20.76%,无规卷曲占27.97%,β转角占5.93%。Phyre2网站预测TrkA蛋白三级结构中85.5%氨基酸处于最合理区。TrKA蛋白含有6个连续B细胞表位和4个非连续表位。成功构建重组质粒pET28a-TrkA并获得高纯度的重组TrkA蛋白。该蛋白免疫小鼠能够诱导产生特异性IgG抗体,血清抗体滴度为1∶25 600。结论 生物信息学分析梅毒螺旋体TrkA为亲水性蛋白,含有B细胞歌表位,纯化的重组TrkA蛋白具有良好的抗原性,能诱导小鼠产生高滴度抗体。