煤焦沥青职业接触人群DNA甲基化和端粒损伤研究

目的研究煤焦沥青职业接触人群p16、FHIT和RASSF1A基因启动子甲基化及端粒损伤情况，探讨煤焦沥青职业接触有效的生物标志。方法选择某碳素厂180例煤焦沥青职业接触工人为接触组，同期在郑州大学第一附属医院进行体检的健康人145例为对照组。用实时荧光定量PCR的方法检测外周血DNA相对端粒长度，实时荧光定量甲基化特异性PCR方法检测外周血DNAp16、RASSF1A和FHIT基因甲基化率，比较两组端粒相对长度和基因甲基化率情况并分析影响因素。结果接触组外周血白细胞DNA端粒相对长度[0．83（0．71～0．90）]低于对照组端粒相对长度[1．13（0．72～1．45）]，差异有统计学意义（Z=-5．395，P〈0．01）。两组p16、FHIT和RASSF1A基因启动子甲基化率的差异无统计学意义（P〉0．05）。经过性别、年龄和是否吸烟的分层分析后发现，在年龄≤40岁时接触组p16基因启动子的甲基化率高于对照组，差异均有统计学意义（Z=-1．914，P=0．011）。结论煤焦沥青职业接触可引起人外周血白细胞DNA端粒长度缩短，对p16、FHIT和RASSF1A基因启动子甲基化率无影响。

焦化厂焦炉工血清中活性氧的检测

目的了解焦炉工血清中活性氧ROS水平。方法用Fenton法对20名炉顶工,20名炉侧工,20名炉底工及20名健康对照进行血清活性氧水平的检测,并进行环境中大气采样,检测空气中苯溶物浓度。结果炉顶工、炉侧工和炉底工血清活性氧水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);炉顶工血清活性氧水平高于炉侧工和炉底工,差异具有统计学意义(P<0.05);炉侧工与炉底工血清活性氧水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论焦炉工长期暴露于焦炉逸散物作业环境中可导致血清活性氧水平升高。

铁蛋白轻链的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:构建FTL的原核表达载体,获得FTL纯化蛋白,制备抗体,为研究其生物学作用奠定基础。方法:采用基因重组技术将PCR扩增的FTL基因产物与原核表达载体pET30a(+)连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果,用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫日本大白兔,制备FTL多抗,采用Western印迹法检验抗体特异性。结果:成功地构建了FTL的原核表达载体,经大肠杆菌中诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到较纯的相对分子质量约25800的融合蛋白,免疫日本大白兔后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与FTL蛋白特异性结合。结论:本研究获得FTL纯化蛋白,制备了FTL多克隆抗体,为进一步研究FTL的作用机制及其在肺癌组织中的表达情况奠定了基础。

半定量RT-PCR检测肺癌组织S100C的表达及其原核表达载体的构建和鉴定

目的分析S100C基因在肺癌组织中的表达情况,并构建S100C蛋白的原核表达载体。方法以β-actin为内参,运用半定量RT-PCR技术检测26例肺癌组织和配对癌旁组织S100C基因mRNA的表达水平;运用RT-PCR技术克隆S100C基因的cDNA全长片段,与PET30a连接构建原核表达载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,进行阳性克隆筛选鉴定。结果肺癌组织中S100C mRNA表达水平低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。成功构建了S100C原核表达载体,序列同源性达100%。结论S100C基因表达下调在肺癌的发生中可能起重要作用;成功构建了S100C原核表达载体。

半定量逆转录-聚合酶链反应检测肺癌组织S100C基因的表达及其原核表达载体的构建和鉴定

目的分析S100C基因在肺癌组织中的表达情况,并构建S100C蛋白的原核表达载体。方法以β-actin为内参,运用半定量RT-PCR技术检测26例肺癌组织和配对癌旁组织S100C基因mRNA的表达水平;运用RT-PCR技术克隆S100C基因的cDNA全长片段,与PET30a连接构建原核表达载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,进行阳性克隆筛选鉴定。结果肺癌组织中S100C mRNA表达水平低于癌旁组织(P<0.05)。成功构建了S100C原核表达载体,序列同源性达100%。结论S100C基因表达下调在肺癌的发生中可能起重要作用;成功构建了S100C原核表达载体。

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞恶性转化细胞端粒损伤研究

目的探讨煤焦沥青致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶变细胞的端粒损伤作用。方法用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测端粒DNA长度和端粒酶活力变化。结果煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞后,30代时诱导组细胞能在软琼脂上形成典型的阳性克隆,染色体二倍体核型比例显著降低,形成恶性转化细胞。BEAS-2B恶性转化细胞端粒DNA长度缩短(0.41±0.03),与正常对照组(1.01±0.08)和二甲基亚砜(DMSO)组(0.92±0.04)比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。BEAS-2B恶性转化细胞端粒酶活力增强(1.62±0.07),与正常对照组(1.03±0.08)和DMSO组(1.11±0.03)比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论端粒损伤在煤焦沥青致细胞恶性转化中起重要作用。

激活蛋白-1与p53基因启动子结合的染色质免疫沉淀技术分析

目的 检测肺腺癌A549细胞内的转录因子激活蛋白-1（AP-1）与p53基因调控区的结合情况。方法采用染色质免疫沉淀技术，用c-jun特异性抗体沉淀DNA，聚合酶链反应（PCR）技术检测p53基因5’端特异性序列。结果在c-jun特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p535’端的特异性序列。结论AP-1在A549细胞内结合于p53基因的调控区，参与该基因的表达调控。