双歧杆菌对食物过敏小鼠肠道屏障功能及Th1/Th2细胞因子的影响

目的:探讨双歧杆菌在改善食物过敏动物肠道屏障功能、调整肠道菌群结构以及对免疫功能调节方面的作用及其机制.方法:无受试蛋白喂养BALB/c小鼠40只,随机分为4组:分别于0、3、9d腹腔注射生理盐水,金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB),卵清蛋白(OVA),SEB+OVA;并于第7、14天给予OVA灌胃.在SEB+OVA致敏组的基础上设立自然恢复组、双歧杆菌作用组、思密达作用组、双歧杆菌+思密达共同作用组,第15天开始分别经灌胃给予不同的药物,连续7d,每日1次.培养法分析粪便菌群,检测血清二胺氧化酶(DAO)含量,ELISA法测定血清IgE、IL-4、INF-γ含量.对肠系膜淋巴结(MLN)及肝、肾、肺组织进行培养以探讨有无细菌移位(BT)发生.同时,采用流式细胞术分析其脾细胞悬液中CD4+CD25+调节性T细胞的数量变化.结果:与SEB+OVA实验组相比,双歧杆菌作用组小鼠血清IgE、DAO含量(A值)、血清IL-4(51.314±3.785ng/Lvs69.980±9.103ng/L,P<0.05)含量显著降低;血清INF-γ水平显著升高(194.281±12.144ng/Lvs133.875±33.822ng/L,P<0.05);脾细胞悬液中CD4+CD25+T细胞数量显著升高(5.778%±0.773%vs4.216%±0.439%,P<0.05);肠道固有菌群中益生菌乳酸杆菌的含量(6.670±0.443vs5.654±0.289,P<0.05)、双歧杆菌的含量(8.611±0.295vs7.491±0.339,P<0.05)显著升高,条件致病菌大肠杆菌的含量(5.364±0.537vs6.718±0.267,P<0.05)、类杆菌的含量(7.427±0.544vs8.606±0.317,P<0.05)显著降低;MLN及外周器官细菌移位率显著降低(12.5%vs37.5%,P<0.05).结论:双歧杆菌可以有效调节机体免疫功能、调整肠道菌群失调及保护肠道黏膜屏障功能.

双歧杆菌对应激大鼠肠道菌群及促肾上腺皮质激素释放激素的影响

目的:探讨应激对大鼠肠道菌群及血清促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)的影响及双歧杆菌对应激大鼠肠道功能的调节作用.方法:50只SD大鼠随机分为5组:正常对照组、压力实验组、双歧杆菌干预组、思密达干预组、双歧杆菌+思密达共同干预组.采用WAS(water avoidance stress)避水实验构建大鼠应激模型,以三糖为探针,衍生化毛细管气相色谱法测定大鼠尿液中三种糖的浓度,以三氯蔗糖/甘露醇(S/M)评价大鼠肠道通透性;取大鼠新鲜粪便,用选择性培养基平皿计数法检测大鼠粪便菌群中几种代表性菌种的数量取肠系膜淋巴结(MLN)培养后测定细菌移位率;用酶联免疫法测定大鼠血清中CRF和促肾上腺皮质激素(ACTH)的含量.结果:与正常对照组相比,压力实验组大鼠粪便中以大肠杆菌杆菌为主的条件致病菌数量增多(7.347±0.277vs7.078±0.229,P<0.05)24h尿液中甘露醇量升高(5.097%±0.453%vs4.718%±0.399%,P<0.05),MLN细菌移位率升高(40%vs10%,P<0.05);CRH(300.8ng/L±34.3ng/Lvs267.0ng/L±32.3ng/L,P<0.05)ACTH(6.79ng/L±0.651ng/Lvs5.68ng/L±0.799ng/L,P<0.05)水平升高.与压力实验组相比,双歧杆菌干预组大肠杆菌(7.044±0.281vs7.347±0.277,P<0.05)、类杆菌(9.075±0.393vs9.485±0.306,P<0.05)数量显著下降细菌移位率下降(10%vs40%,P<0.05);ACTH水平下降(5.92ng/L±0.477ng/Lvs6.79ng/L±0.651ng/L,P<0.05).结论:在慢性应激条件下,大鼠出现肠道菌群失调、肠道通透性升高、神经内分泌处于应激状态的现象,双歧杆菌能够缓解慢性应激所导致的上述现象.

TIM1与TIM4对小鼠食物过敏模型中CD4^+CD25^+调节性T细胞功能的影响

目的:探讨在食物过敏小鼠模型中CD4+CD25+Treg细胞的功能状态及TIM4与TIM1对其的影响,分析食物过敏的发生机制.方法:无受试蛋白喂养BALB/c小鼠32只,随机分为4组:空白对照组、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)+卵清蛋白(OVA)共同作用组、TIM1抗体干预组及TIM4抗体干预组,分别于0、3、9dip生理盐水,SEB和OVA,TIM1抗体+SEB+OVA,TIM4抗体+SEB+OVA,并于第7、14天给予SEB+OVA(空白对照组以生理盐水ig)ig.RT-PCR检测空肠及脾脏Foxp3mRNA表达、空肠TIM4mRNA表达,ELISA法测定血清TGF-β1与IL-10的表达.免疫组织化学法检测空肠黏膜TGF-β1与IL-10表达.结果:与空白对照组相比,SEB+OVA共同作用组小鼠空肠及脾脏Foxp3mRNA表达明显下降(0.401±0.145vs0.732±0.162;0.407±0.082vs0.691±0.145,均P<0.05),TIM4mRNA表达明显增高(P<0.05),血清和空肠黏膜TGF-β1表达显著降低(7859.853±126.704ng/Lvs8342.814±488.461ng/L;108.834±9.634ng/Lvs156.298±12.002ng/L,均P<0.05);与SEB+OVA组相比,TIM1和TIM4抗体干预组小鼠空肠及脾脏Foxp3mRNA及血清和空肠黏膜TGF-β1表达显著增高(均P<0.05).结论:TIM4与TIM1抗体干预可恢复SEB+OVA致敏小鼠Treg细胞功能,维持耐受平衡,减轻过敏症状,提示TIM4-TIM1通路可能在食物过敏的发生中起重要作用.

CRF通过CRF2受体介导肠上皮细胞中TLR4的表达

目的:研究促肾上腺皮质释放因子(CRF)介导肠上皮细胞中Toll样受体4(toll-like receptor4,TLR4)的表达,并探讨其可能通过的受体途径.方法:常规培养人结肠上皮细胞株HT-29细胞,将HT-29细胞分为正常对照组(不加刺激剂),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激组(LPS20g/L刺激24h),促肾上腺皮质释放因子(corticotrophin-releasing factor,CRF)刺激组(CRF20g/L刺激24h),CRF+LPS刺激组(预先CRF20g/L刺激12h,更换细胞液后再与LPS20g/L刺激12h),CRF+Antalarmin 组(CRF与Antalarmin20g/L共刺激24h),CRF+LPS+Antalarmin组(CRF与Antalarmin20g/L共刺激12h后再以LPS刺激12h),CRF+Astressin2B组(CRF与Astressin2B20g/L共刺激24h),CRF+LPS+Astressin2B组(CRF与Astressin2B20g/L共刺激12h后再以LPS刺激12h).刺激结束后,收取各组HT-29细胞,RT-PCR法和免疫印迹法检测各组上皮细胞中TLR4mRNA和蛋白的表达.ELISA法检测各组细胞上清液中IL-8的表达.结果:CRF可以诱导人结肠上皮细胞株HT-29细胞中TLR4表达导致IL-8分泌增多(P<0.05),C R F1受体拮抗剂不能有效地阻滞C R F对TLR4的诱导(P>0.05,CRF+LPS组vs CRF组),CRF2受体拮抗剂可阻滞CRF对TLR4的诱导(P<0.05,CRF+LPS组vs CRF组).结论:CRF通过CRF2受体通路介导肠上皮细胞中TLR4的表达.

肠上皮细胞来源的整合素αVβ6对肠道树突状细胞TGF-β1表达的影响

目的:肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)来源的整合素V6在肠道耐受性树突状细胞(tolerance dendritic cell,TolDC)生成中的机制研究.方法:Balb/c♂小鼠30只,随机分为3组:空白对照组、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)组、OVA+抗V6抗体组.取空肠分离固有层单核细胞(lamia propria mononuclear cells,LPMC)流式细胞仪测定CD11c+与转化生长因子1+(transforming growth factor-1+,TGF-1+)的比率变化.免疫荧光双染(immunofluorescence double staining,IF)检测空肠CD11c+与TGF-1+分布情况.Western bolt法测定TGF-1蛋白水平变化.结果:流式细胞仪测定结果显示:与空白对照组相比,OVA组肠道LPMC中的TGF-1+明显增加(P<0.05),而OVA+抗V6抗体组TGF-1+明显降低(P<0.05).与OVA组相比,OVA+抗V6抗体组TGF-1+明显降低(P<0.05).免疫荧光双染法显示:O VA组中TolDC细胞计数为(13.0±1.76),较空白对照组(4.9±1.66)显著增加(P<0.01),该组中CD11c+DC细胞计数(5.0±1.83),较空白对照组(8.1±1.91)显著减少(P<0.01);OVA+抗V6抗体组中TolDC细胞计数为(3.2±1.37),较空白对照组(4.9±1.66)无明显变化(P>0.01),该组中CD11c+DC细胞计数(11.0±2.16),较空白对照组(8.1±1.91)无明显变化(P>0.01).Western bolt结果显示:与空白对照组相比(0.129±0.069),OVA组(0.236±0.049)TGF-1表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);OVA+抗V6抗体组(0.174±0.075)表达也降低,差异有统计学意义(P<0.05).与OVA组相比,OVA+抗V6抗体组(0.174±0.075)TGF-1表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论:肠上皮来源整合素V6能够增加树突状细胞(dendritic cell,DC)中TGF-1的表达,并使其转变为TolDC,从而在肠道免疫耐受中起重要作用.

TIM4对小鼠食物过敏模型中抗原特异性Th2细胞分化的影响

目的:研究微生物产物对树突状细胞(dendriticcell,DC)和TIM4的作用,探讨在微生物产物参与的食物过敏(foodallergy,FA)中TIM4对CD4+T淋巴细胞分化的影响.方法:培养Balb/c小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-derived DC,BMDC),培养的DC分为两组:金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激组和空白对照组,RT-PCR检测不同组DC的TIM4 mRNA表达;流式细胞仪检测DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表达.在DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中将培养的DC分为5组:空白对照组、SEB+卵清蛋白(OVA)组、SEB组、OVA组及TIM4组,同时取过敏模型小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,不同组的DC与CD4+T淋巴细胞共同培养,ELISA法测定混合培养细胞上清液IL-4与IFN-γ的表达.结果:与空白对照组相比,SEB组DCTIM4 mRNA表达明显增高(0.941±0.018vs0.422±0.083,P<0.05),并具有剂量依从性.SEB组DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达明显高于空白对照组(MHC-Ⅱ:76.684%±3.1803%vs52.984%±3.6026%;CD86:89.746%±2.113%vs67.558%±0.4341%,均P=0.000).DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中,相比空白对照组,SEB+OVA组IL-4表达显著增高(295.834±20.408vs78.335±13.109,P<0.05),而IFN-γ的表达明显减少(362.109±92.271vs761.897±102.967,P<0.05);单独的SEB组或OVA组IL-4和IFN-γ与空白对照组无明显差异;TIM4组中IL-4的表达水平较SEB+OVA组明显降低,而IFN-γ的表达明显增高(90.511±15.500vs295.834±20.408;807.734±95.436vs362.109±92.271,均P<0.05).结论:微生物产物和食物抗原共同作用导致FA,TIM4参与FA的发生.消除TIM4的表达可明显抑制Th2细胞分化,有效纠正Th1/Th2细胞失衡,可阻止过敏性免疫反应.

肠上皮细胞来源整合素αVβ6对树突状细胞功能的影响

目的:研究肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)来源的整合素αVβ6对骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)功能的影响.方法:分离、培养小鼠IEC和DC,IEC经卵清蛋白(ovalbumin,OVA)刺激后,多步离心法制备外泌体(exosome).应用免疫胶体金对外泌体中的整合素αVβ6进行定性,通过免疫磁珠技术,分离获取DC,流式细胞仪检测分离后DC纯度.然后将分离后的DC分5组,分别为空白组、OVA组、外泌体组、外泌体+抗整合素αVβ6抗体组、外泌体+羊抗小鼠IgG组,观察各组对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的反应.ELISA法检测DC在LPS刺激前后IL-12p70的表达.LPS刺激前活性转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及总TGF-β1的表达.结果:OVA组与空白组相比,总TGF-β1表达明显增高(226.636±40.355vs176.947±23.072,P<0.05),但活化TGF-β1表达无明显变化(P>0.05).空白组与外泌体+抗整合素αVβ6抗体组相比,活化TGF-β1表达无明显变化(P>0.05),但总TGF-β1表达明显增高(P<0.05).外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组与空白组相比,活化TGF-β1和总TGF-β1表达均明显增高(P<0.05).相比空白对照组,LPS刺激48h后外泌体组和外泌体+羊抗小鼠IgG组IL-12p70表达明显降低(P<0.05),OVA组及外泌体+抗整合素αVβ6抗体组IL-12p70表达无明显差异(P>0.05).结论:IEC来源整合素αVβ6能增加DC活性,以及TGF-β1和总TGF-β1的表达量,并拮抗LPS对BMDC的促成熟作用.

婴儿双歧杆菌对花生过敏小鼠模型肠道Th2反应的调节

目的研究婴儿型双歧杆菌对花生过敏小鼠肠道Th2型反应的调节作用。方法通过应用花生蛋白诱导肠道的Th2型反应,建立食物过敏小鼠模型。过敏小鼠灌胃给予婴儿型双歧杆菌(ATCC菌或CGMCC0313-2)或不做处理。然后分离小鼠小肠黏膜CD4+T细胞或DC,另取肠黏膜组织进行石蜡包埋甲苯胺蓝染色肥大细胞计数,HE染色进行嗜酸细胞和单个核细胞计数,流式细胞检测CD4+T中Th2(CD4+IL-4+T)细胞和Treg(CD4+CD25+Foxp3+T)比例,另取CD4+T进行CFSE标记,与DC共培养4 d后流式细胞检测CD4+T增殖反应,收集细胞培养液ELISA检测IL-4、IL-5和IL-13分泌水平。结果过敏组小鼠Th2型细胞数,CD4+T细胞增殖反应,IL-4、IL-5和IL-13水平,肠黏膜中肥大细胞、嗜酸性细胞和单个核细胞数均明显高于对照组(P<0.01),而Treg数目低于对照组(P<0.01),婴儿双歧杆菌干预后,婴儿双歧杆菌组Th2型细胞数,IL-4、IL-5和IL-13水平,肠黏膜中肥大细胞、嗜酸性细胞和单个核细胞数均明显低于过敏组(P<0.01),而Treg数目高于过敏组(P<0.01)。结论口服婴儿型双歧杆菌可以抑制花生过敏导致的肠道Th2型反应。