重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其生物学活性

为了研究重组人纤溶酶原Kringle15(K15)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响,通过PCR扩增人纤溶酶原K15cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pETK15,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western杂交检测K15的表达。鸡胚尿囊膜(CAM)实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle15对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pETK15在E.coliBL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%,K15主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Nispin亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K15蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K15能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K15特异地抑制内皮细胞的增殖,而对非内皮细胞无抑制作用。

siRNA阻断NF-κB信号通路抑制宫颈癌HeLa229细胞的增殖及侵袭

目的通过RNA干扰阻断宫颈癌HeLa229细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药和侵袭力的关系。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为转染组和对照组,MTT法检测细胞增殖,Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力。结果MTT实验表明,转染组细胞存活率比对照组明显下降,联合应用化疗药,转染组和对照组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降,但在同一浓度,siRNA与5-Fu联合应用可明显提高HeLa229细胞对化疗药的敏感性。体外侵袭实验结果表明,和对照组相比,转染P65siRNA组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P<0.05)。结论应用RNAi技术可有效阻断NF-κB信号通路,抑制宫颈癌细胞的增殖和体外侵袭力,增强对5-Fu的敏感性。因此,可将NF-κB信号通路作为宫颈癌基因治疗的靶点。

信号肽-canstatin真核表达载体的构建及其在Eca-109细胞中的分泌表达

目的:构建信号肽-canstatin真核表达载体并在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。方法:利用点突变技术将小鼠纤溶酶原信号肽(SP)序列插入到载体pEGFP-C1 EGFP编码序列起始密码的后面,构建pEGFP-C1-SP载体。以pMD18T-Can为模板,扩增小鼠canstatin基因,构建信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can。用脂质体转染法瞬时转染人食管癌细胞Eca-109。利用W estern b lotting检测小鼠canstatin融合蛋白在Eca-109细胞中的分泌表达。结果:DNA测序证明所构建的带信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP正确;酶切和DNA测序表明信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can构建正确,EGFP-cansta-tin融合蛋白在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。结论:获得了能分泌canstatin融合蛋白的真核表达载体,并分泌到人食管癌细胞Eca-109的细胞外,为小鼠canstatin的功能研究及应用于基因治疗提供了实验基础。

siRNA阻断NF-κB信号通路联合5-Fu对食管鳞癌细胞周期的影响

目的利用RNAi技术特异性的抑制NF-κB亚单位p65的表达,探讨在食管鳞癌细胞中将NF-κB作为基因治疗靶点的价值。方法将荧光素标记的对照siRNA转染到食管鳞癌细胞中观察转染效率,p65siRNA转染到EC9706和Eca109细胞中,使用Western blot的方法检测p65和Cyclin D1蛋白的表达,使用EMSA法检测转染前后p65与DNA结合活性的变化;流式细胞仪检测p65siRNA与5-Fu(327μg/ml)单独或联合应用,对食管鳞癌细胞周期的影响。结果荧光素标记的siRNA转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。在转染后的EC9706和Eca109细胞中,p65和Cyclin D1蛋白的表达水平下调;NF-κB与DNA的结合活性明显下降;G0/G1期的细胞开始增加,同时S期的细胞逐渐减少;当转染p65siRNA细胞联合使用5-Fu时,G0/G1期的细胞明显增加,同时S期的细胞明显减少。结论p65siRNA可以特异性的阻断NF-κB信号通路,下调NF-κB下游基因中细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,表明活化的NF-κB信号通路可以成为食管鳞癌基因治疗中一个重要的分子靶点。

盐藻肌动蛋白基因启动子驱动的bar基因表达作为核转化筛选标记(英文)

运用基因组步行方法克隆盐藻肌动蛋白基因 5′上游调控序列,发现相对于ATG上游 -573和 -424b的位置上分别有 75bp长的两个重复序列。没有典型的TATA盒,但有两个TATA样结构、一个CCAAT结构和一个与GCTC(G/C)AAGGC一致的序列。以 700bp的盐藻肌动蛋白基因启动子区序列驱动bar基因的表达作为转化盐藻的筛选标记。转化的藻细胞暗光恢复 24h后,在含 0 5μg/mL除草剂的培养基中常规培养生长 1周,然后将细胞平铺于含 0 5μg/mL除草剂的固体培养基上继续筛选培养。约 20d后从固体培养板上挑选出 5个藻落并作了进一步培养和分析。结果显示, 5个转化藻中携带bar嵌合基因的整合位点均位于核基因组内。Southerblotting分析表明,仅有一个转化藻整合单拷贝的bar基因,而另外 4个转化藻株则包含多个拷贝bar基因片段,提示盐藻核基因转化主要是外源基因的随机整合,外源基因在转化盐藻中的整合拷贝数并不影响其除草剂抗性RT PCR方法证明了bar基因在转化藻中的转录。5个转化藻在含除草剂的液体培养基中维持生长了至少 7个月,表明核基因转化的稳定性。

杜氏盐藻GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建

根据藻类甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸高度保守序列设计简并引物,采用5′,3′-RACE和巢式PCR的方法,得到了杜氏盐藻(Dunaliella salina)GAPDH cDNA全长序列。序列同源性比较和进化树等生物信息学分析结果表明,根据获得的盐藻GAPDH的核酸序列推导的氨基酸序列与其他已知物种的GAPDH有较高的同源性。定向克隆于原核表达载体的盐藻GAPDHcDNA在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到了高效表达,并成功构建了由盐藻GAPDH基因启动子驱动的cat(氯霉素乙酰转移酶)基因表达载体pUCGCat,为进一步研究杜氏盐藻GAPDH基因和启动子功能奠定了试验基础。

小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18 T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can N,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatincDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatinN端片段(1 95aa)与人的同源性为100%。IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can N在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35%和18%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank,接受号分别为:AY375463和AY502946。

重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英文)

为了研究重组小鼠canstatinN端片段的体内抗血管生成活性 ,通过PCR扩增小鼠canstatinN端片段cDNA ,定向克隆于原核表达载体 pET30a (+)中 ,构建小鼠canstatinN端片段重组表达载体 pET mCanN ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatinN端片段的表达 .结果表明 ,IPTG诱导原核表达载体 pET mCanN在大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)中高效表达 ,小鼠canstatinN端片段表达量约占菌体总蛋白量的 18% ,小鼠canstatinN端片段主要以包涵体形式存在 ,包涵体经过洗涤、裂解、Ni spincolumn亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后 ,获得了纯度约为 92 %的重组小鼠canstatinN端片段 .鸡胚绒毛尿囊膜 (chickenembryochoriollantoicmembrane ,CAM)实验表明 ,原核表达的小鼠canstatinN端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成 .

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatin C端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin C端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET/ mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatin C端片段的cDNA 长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatin C端片段氨基酸的同源性为61%。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatin C端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达。小鼠canstatin C端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。

实时荧光定量聚合酶链反应检测杜氏盐藻突变株中硝酸盐还原酶基因的表达

目的分析获得的2株杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)突变藻株(M1和M2)中NR基因的表达情况。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法,以管家基因β-actin作为内参,进行相对定量检测比较NR基因的表达变化。结果盐藻突变藻株NR基因相对表达量明显低于野生型杜氏盐藻。所分离的杜氏盐藻NR突变藻株中确实存在NR基因的突变。结论本研究为最终利用NR基因作为选择标记,建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定了实验基础。