LINC00665通过miR-146a-5p对肺癌A549细胞增殖的影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-cording RNA,lncRNA)LINC00665和miR-146a-5p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达情况及其相互作用对肺癌细胞增殖的影响。方法选取经病理检查确诊且手术切除的小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)组织和癌旁组织各37例,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肺癌组织及癌旁组织中LINC00665和miR-146a-5p的表达;在肺癌细胞系A549中构建LINC00665小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)载体或转染miR-146a-5p mimic;CCK8法测定A549细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00665对miR-146a-5p的调控关系。结果癌组织中LINC00665相对表达量为(3.23±1.63),高于癌旁组织的(1.15±0.54);而癌旁组织中miR-146a-5p相对表达量为(0.93±0.47),高于癌组织的(0.32±0.24);LINC00665在TNMⅢ期癌组织中表达(4.07±1.39),高于TNMⅠ/Ⅱ期的(2.71±1.56),差异均有统计学意义(P<0.05)。在A549细胞中,抑制LINC00665或过表达miR-146a-5p均可抑制细胞增殖,导致细胞周期阻滞,差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实LINC00665可以通过预测的吸附位点吸附miR-146a-5p,参与肺癌细胞增殖的调控。结论肺癌LINC00665可以通过靶向降低miR-146a-5p表达,促进肺癌细胞的增殖,导致细胞周期停滞,为肺癌诊断和治疗提供新靶点。

外泌体透射电镜样品的制备方法

目的为了达到更好的透射电镜观察效果,总结出一种适用于外泌体等超微结构样品的制备方法。方法以巨噬细胞外泌体为例,培养巨噬细胞RAW264.7并提取上清液,超速离心纯化外泌体。磷酸缓冲液重悬后稀释5倍、10倍、20倍3个浓度梯度,在碳覆膜铜网上分别滴加样品,吸附90 s,醋酸铀染液负染30 s,透射电镜下观察并总结外泌体样品制备方法。结果透射电镜下可以看到,300目铜网上的外泌体浓度在1.0×10 11/ml左右时,外泌体数量适中,直径在100 nm左右,能明显看到圆盘状,膜结构完整,轮廓清晰。结论相较于常规超薄切片法,这种电镜样品制备方法用于外泌体、核酸、小分子蛋白、人工合成蛋白、纤维、纳米材料等超微结构样品的制备,更有利于透射电镜观察。

长链非编码RNA-TCONS00041960对大鼠激素性股骨头坏死模型中成脂和成骨基因表达的影响

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)-TCONS00041960在大鼠激素性股骨头坏死模型中对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和成骨基因runt相关转录因子2(Runx2)表达的调控作用。方法健康SD大鼠64只,随机分为4组:(1)正常对照组(Blank组)。每次臀肌注射2 ml生理盐水,连续3 d。(2)激素组(Dex组)。每次臀肌注射地塞米松20 mg/kg,连续3 d,制作大鼠激素性股骨头坏死模型。(3)无关序列组(Ex-NC+Dex组)。同法给予地塞米松,一侧股骨头内注入转染无关序列慢病毒载体的骨髓间充质干细胞(BMSCs)。(4)激素+重组慢病毒组(Ex-Lnc+Dex组)。同法给予地塞米松,一侧股骨头内注入转染重组lncRNA TCONS00041960 lncRNA载体的BMSCS。于实验第4、8周提取各组大鼠股骨头组织中总RNA及总蛋白,应用TaqMan实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)与蛋白质印迹法(Western blot)检测成脂基因PPARγ、成骨特异性转录因子Runx2 mRNA及其蛋白表达。两样本两组间比较采用t检验;数值变量资料统计采用方差分析,组间比较采用最小显著性差异法(LSD)。结果实验第4周,Ex-Lnc+Dex组股骨头细胞内PPARγ mRNA与蛋白呈低表达(1.129±0.024与0.366±0.007),与Blank组(1.001±0.055与0.352±0.003)接近,差异均无统计学意义(t4w-mRNA=3.052,P>0.05;t4w-蛋白=3.227,P>0.05);明显低于Dex组(2.351±0.086与0.836±0.032)、Ex-NC+Dex组(2.226±0.484与0.888±0.067),差异均有统计学意义(F4w-mRNA=296.841,P<0.01;F4w-蛋白=196.684,P<0.01)。Ex-Lnc+Dex组Runx2 mRNA与蛋白呈高表达(1.176±0.036与0.963±0.014),与Blank组(1.001±0.077与0.934±0.019)接近,差异均无统计学意义(t4w-mRNA=2.893,P>0.05;t4w-蛋白=2.154,P>0.05);明显高于Dex组(0.522±0.007与0.501±0.005)、Ex-NC+Dex组(0.614±0.003与0.521±0.008),差异均有统计学意义(F4w-mRNA=376.700,P<0.01;F4w-蛋白=2 239.834,P<0.01)。实验第8周各组表达量与第4周一致。结论重组lncRNA-TCONS00041960载体能够有效下调大鼠激素性股骨头坏死(ONFH)模型股骨头细胞内成脂基因表达,同时显著上调细胞内成骨基因表达,可高效预防激素性ONFH的发生。