医学微生物学实验教学中开展自主综合性实验的探讨

医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分。为提高学生对医学微生物学实验的学习兴趣,在实验教学中开展自主综合性实验的实验模式,有助于培养学生的动手能力、分析问题和解决问题的能力,为今后学习和工作奠定良好的基础。

高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒DNA及其变异

构建了新型纳米金比色芯片,利用Taq DNA连接酶的连接特异性,将其与乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)靶序列完全互补杂交的捕获探针(固定在芯片上)和纳米金修饰的探针连接成一条链,从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上,再通过银染反应放大,形成裸眼可见的显色信息。通过点阵的位置及灰度,即可判断HBV-DNA靶序列的单碱基突变,并得出相对定量信息。本实验对不同浓度的HBV-DNA靶序列进行了检测。结果显示:此技术对单碱基突变有很强的特异性识别能力,并且具有较高的灵敏度(约10pmol/L),在10～100pmol/L浓度范围内表现出较好的线性关系。该技术检测时间短(<1h)、操作简单、不需要特殊的检测设备,具有很好的临床应用前景。

激素对兔骨髓间充质干细胞神经递质表达的影响

背景:激素性股骨头坏死的确切发病机制仍未清楚,研究发现神经系统可通过多种途径调控骨髓间充质干细胞的分化,激素可能通过影响其调控机制而引起骨坏死。目的:观察在激素作用下,骨髓间充质干细胞中神经递质或其受体mRNA表达的变化。方法:密度梯度离心和贴壁培养获得兔骨髓间充质干细胞。将传代培养的第3代细胞随机分为两组,实验组加入浓度为10-7mol/L的地塞米松,对照组正常培养。分别于诱导后第4,7,11,15天,测定细胞中神经生长因子、成纤维细胞生长因子、降钙素相关基因肽受体、血管活性肠肽受体、P物质受体及过氧化物酶体增殖子活化受体γ的mRNA表达。结果与结论:实验组神经生长因子、成纤维细胞生长因子、降钙素相关基因肽受体、血管活性肠肽受体和P物质受体的mRNA表达较对照组明显降低,而过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA表达较对照组明显增高,差异均具有显著性意义(P<0.01),实验组各因子在不同时间点间进行比较却无明显差异(P>0.05)。结果表明大剂量激素可使骨髓间充质干细胞中具有成骨或成血管作用的神经递质或其受体表达下降,这可能与激素性股骨头坏死发生的机制有关。

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.

乙醇改变骨髓间充质干细胞神经肽的表达

背景:研究发现骨髓间充质干细胞的分化受神经系统调控。目的:观察乙醇对人骨髓间充质干细胞降钙素基因相关肽受体、P物质受体、过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA及Runx2mRNA表达的影响。方法:将第2代人骨髓间充质干细胞随机分组培养:实验组加入0.09mol/L乙醇,对照组正常培养。结果与结论:培养11d后,实验组降钙素基因相关肽受体、P物质受体、Runx2mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01),过氧化物酶体增殖子活化受体γmRNA水平较对照组明显增高(P<0.01)。表明乙醇改变了骨髓间充质干细胞中神经肽类物质的表达,减弱了其向成骨细胞方向分化。

人羊膜间充质干细胞移植对荷瘤鼠C6胶质瘤生长的抑制

背景:实验室前期课题成果显示,脐血或羊膜间充质干细胞具有亲肿瘤及抑瘤特性。目的:探讨人羊膜间充质干细胞对C6胶质瘤细胞生长的抑制作用。设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-06/09在郑州大学微生物与免疫教研室完成。材料:胎盘来源于郑州大学一附院妇产科健康剖宫产产妇,C6胶质瘤细胞株由北京神经外科研究所惠赠,10只BALR/c裸鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。方法:无菌条件下取胎盘,分离部分羊膜,体外分离培养人羊膜间充质干细胞,传至第3代用于实验。10只裸鼠背部双侧皮下注射含3×106个C6胶质瘤细胞的DMEM/F12培养基,建立双侧荷瘤鼠模型。成功造模后,模型对照组于裸鼠左侧皮下注射DMEM/F12培养基50μL,细胞移植组于同一裸鼠右侧皮下注射含2×106个羊膜间充质干细胞的等量DMEM/F12培养基。主要观察指标:肿瘤生长情况,周围组织浸润及新生血管形成等病理学观察,免疫组化法检测肿瘤中细胞周期素D1的表达。结果:细胞移植后14,21d,细胞移植组肿块体积明显小于模型对照组(F=54.127,P<0.05)。模型对照组瘤体呈结节状,部分肿瘤组织中心有坏死现象,内部有新生血管形成,肌层及皮肤浸润较明显,已达腹膜;细胞移植组瘤体分叶较少,无新生血管形成,仅有局部的皮肤浸润,未见肌层浸润。模型对照组细胞周期素D1蛋白呈阳性表达,而细胞移植组表达阳性率较低。结论:人羊膜间充质干细胞可明显抑制荷瘤鼠C6胶质瘤细胞的生长,同时可抑制细胞周期素D1蛋白的异常表达。

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞,为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法分离新生豚鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组化技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达Nestin;荧光染料的标记效率可达93.4%,细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力,荧光染料的标记可获得较高的标记效率,可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。

异基因骨髓间充质干细胞移植对EAE小鼠的治疗作用

目的探讨异基因骨髓间充质干细胞(BMSC)对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的治疗作用及相关免疫调节机制。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)多肽片段诱导建立C57BL/6J小鼠EAE模型;分离纯化培养BALB/c小鼠BMSC,对EAE模型小鼠进行移植,移植前后对EAE小鼠进行神经功能评分;流式细胞术检测小鼠淋巴器官CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg)的数量;荧光定量RT-PCR检测小鼠脾脏IL-2、IL-4、IL-17和IL-23 mRNA水平的表达。结果异基因BMSC移植后小鼠神经功能评分明显改善;BMSC移植组小鼠胸腺、脾脏、淋巴结Treg数量显著增加;脾脏中IL-2、IL-17表达显著下降,同时IL-4、IL-23表达显著增加。结论异基因BMSC移植通过调节免疫系统的Treg数量和CD4+T细胞分泌细胞因子的水平对EAE起治疗作用。

间充质干细胞移植对EAE小鼠Treg细胞功能的影响

目的:探讨间充质干细胞(MSCs)对EAE小鼠Treg细胞数量和功能的影响。方法:以MOG多肽免疫C57BL/6J小鼠建立EAE模型;分离培养小鼠骨髓MSCs,尾静脉移注EAE模型小鼠;移植后流式细胞术检测小鼠胸腺、脾脏、淋巴结CD4+CD25+T细胞比例;荧光定量RT-PCR检测脾脏、淋巴结Foxp3 mRNA水平及IL-10、TGF-β1、IL-4的表达;免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞,体外检测CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。结果:MSCs移植改善了EAE小鼠的神经功能评分;与EAE组相比MSCs移植组小鼠脾脏、淋巴结和胸腺Treg细胞数量显著增加(P<0.05),外周淋巴器官中Foxp3 mRNA水平逐渐升高,并且IL-10、TGF-β1 mRNA水平逐渐升高至正常水平;与EAE组相比MSCs移植组Treg细胞对Teff细胞增殖作用显著增强,P<0.05。结论:MSCs移植提高了Treg细胞的数量和功能,通过免疫调节改善了EAE的进程。

红细胞体积分布宽度与心力衰竭患者预后指标关系的研究

目的探讨红细胞体积分布宽度与心力衰竭患者预后指标的关系,为临床干预提供参考。方法选取2012年4月~2014年7月本院收治的184例心力衰竭患者作为研究对象。其中心力衰竭死亡患者64例,心力衰竭生存患者120例;心血管疾病（CVD）患者50例,非CVD患者70例。收集、记录患者的相关病历资料,并进行统计学分析。结果心力衰竭死亡患者的红细胞体积分布宽度均值为17.9%,标准差为3.1。CVD患者的红细胞体积分布宽度均值为16.9%,标准差为2.9;非CVD患者的红细胞体积分布宽度均值为16.6%,标准差为3.2。红细胞体积分布宽度〉16.0%是心力衰竭的最佳Cut-off值。心力衰竭死亡患者和心力衰竭生存患者的NYHA分级、左心射血分数、高血压、收缩压、舒张压、白细胞、C-反应蛋白、脑利钠肽和红细胞体积分布宽度比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。多因素Logistic回归分析显示,红细胞体积分布宽度和C-反应蛋白是影响心力衰竭预后结果的独立危险因素。结论红细胞体积分布宽度和C-反应蛋白是影响心力衰竭预后结果的独立危险因素。

鱼腥草对HIV假病毒作用的初步研究

目的:观察鱼腥草体外对HIV假病毒的作用。方法:鱼腥草给予大鼠灌胃,采血制备含药血清;HIV假病毒载体pNL4-3 Luc R-E-和质粒phRL-SV40瞬时转染HEK293T细胞;含药血清刺激各组细胞,培养24 h后观察荧光素酶活性及检测P24蛋白含量。结果:实验组的荧光素酶值和P 24蛋白含量均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:鱼腥草对HIV假病毒复制具有一定的抑制作用,推测其具有潜在的抗艾滋功效。

互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的:探讨互隔交链孢酚(Alternariol,AOH)对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法:20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果:与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加(P<0.05);用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论:AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.

CEA特异性RNAi增强基因工程腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤

目的研究癌胚抗原(CEA)特异性基因沉默对基因工程腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEAsiRNA载体,通过基因转染,在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,H101瘤内注射。用RealTimePCR和免疫组化法检测CEA在移植瘤中的表达,测量肿瘤体积。结果降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和大小无明显影响,H101瘤内注射后,干扰组肿瘤体积显著小于空载体组和对照组(P<0·05)。结论抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达,能增强H101的敏感性。

人MAGE-12基因的克隆与序列分析

目的克隆人MAGE-12基因并测序。方法从人肺癌组织中提取mRNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-12基因片段,对其进行PvuⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-Teasy载体中,转化JM109菌;进行蓝白筛选后,运用pGEM-Teasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果PCR扩增得到944bp的基因片段,经PvuⅡ酶切初步证实为MAGE-12基因;阳性克隆经筛选鉴定连接有目的基因;目的基因测序结果与GenBank比较,结果完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-Teasy。结论成功克隆MAGE-12基因,为MAGE-12用于肿瘤的生物治疗做出准备工作。

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C_3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。

新生豚鼠神经干细胞的分离培养及鉴定和标记(英文)

背景:神经干细胞为内耳移植治疗感音神经性聋带来希望,而豚鼠是氨基甙类药物中毒性耳聋动物模型的首选动物,且经过几十年研究已建立了成熟的动物模型。如何从豚鼠海马中提取神经干细胞并标记,是内耳干细胞移植所要解决的问题之一。目的:从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞,为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。设计:单一样本观察。单位:郑州大学微生物与免疫教研室。材料:实验于2005-03/06在郑州大学微生物与免疫教研室完成。新生24h内豚鼠(由郑州大学实验动物中心提供)50～80g/只,雌雄均有。方法:分离新生豚鼠海马组织,用含碱性成纤维生长因子和表皮生长因子无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学技术检测其巢蛋白的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。主要观察指标:①观察神经干细胞体外生长情况。②免疫荧光检测鉴定神经干细胞巢蛋白表达。③荧光标记干细胞并检测标记率。结果:①从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团。②神经干细胞能表达巢蛋白。③荧光染料DAPI的标记效率可达93.4%,细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论:从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力,荧光染料的标记可获得较高的标记效率,可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。

真核表达载体pEGFP-C_3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1,为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13.5d胚胎组织中扩增出两端带有H indIII和EcoR I酶切位点的MASH1 cDNA编码片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明:重组质粒PEGFP-C3含有MASH-I片段,方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-I。

rhEGF基因治疗角膜碱烧伤的实验研究

目的探讨重组人表皮生长因子(rhEGF)基因缓释型滴眼液对兔角膜碱烧伤的基因治疗。方法新西兰白兔75只,分为A(rhEGF-pcDNA3.1-脂质体基因滴眼液)、B(rhEGF衍生物滴眼液)、C(pcDNA3.1空质粒-脂质体对照组)三组分别点眼治疗兔角膜碱烧伤。每天观察模型眼眼表、荧光素染色并照相。分别测定hEGFmRNA、hEGF和EGFR在角膜组织中的表达。结果A组眼表结膜充血、分泌物、角膜水肿和角膜混浊程度均比B组和C组轻。角膜荧光素染色显示A组角膜上皮的溃疡面积较B组和C组范围小,21d转为阴性。A组基因在行滴眼24h后在全层角膜细胞内可见hEGFmRNA和蛋白质表达,第3d达高峰,细胞阳性率高达95%,随后逐渐降低,21d仍有弱表达。结论rhEGF-PcDNA3.1-脂质体基因滴眼液能够降低角膜的炎症反应,促进角膜上皮细胞的增生,加速角膜碱烧伤的损伤修复过程。

TIM4对小鼠食物过敏模型中抗原特异性Th2细胞分化的影响

目的:研究微生物产物对树突状细胞(dendriticcell,DC)和TIM4的作用,探讨在微生物产物参与的食物过敏(foodallergy,FA)中TIM4对CD4+T淋巴细胞分化的影响.方法:培养Balb/c小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-derived DC,BMDC),培养的DC分为两组:金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激组和空白对照组,RT-PCR检测不同组DC的TIM4 mRNA表达;流式细胞仪检测DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表达.在DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中将培养的DC分为5组:空白对照组、SEB+卵清蛋白(OVA)组、SEB组、OVA组及TIM4组,同时取过敏模型小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,不同组的DC与CD4+T淋巴细胞共同培养,ELISA法测定混合培养细胞上清液IL-4与IFN-γ的表达.结果:与空白对照组相比,SEB组DCTIM4 mRNA表达明显增高(0.941±0.018vs0.422±0.083,P<0.05),并具有剂量依从性.SEB组DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达明显高于空白对照组(MHC-Ⅱ:76.684%±3.1803%vs52.984%±3.6026%;CD86:89.746%±2.113%vs67.558%±0.4341%,均P=0.000).DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中,相比空白对照组,SEB+OVA组IL-4表达显著增高(295.834±20.408vs78.335±13.109,P<0.05),而IFN-γ的表达明显减少(362.109±92.271vs761.897±102.967,P<0.05);单独的SEB组或OVA组IL-4和IFN-γ与空白对照组无明显差异;TIM4组中IL-4的表达水平较SEB+OVA组明显降低,而IFN-γ的表达明显增高(90.511±15.500vs295.834±20.408;807.734±95.436vs362.109±92.271,均P<0.05).结论:微生物产物和食物抗原共同作用导致FA,TIM4参与FA的发生.消除TIM4的表达可明显抑制Th2细胞分化,有效纠正Th1/Th2细胞失衡,可阻止过敏性免疫反应.

人舌癌Tca8113肿瘤抗原对树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响

目的探讨人舌癌Tca8113细胞肿瘤抗原体外诱导外周血来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)对CTL杀伤活性的影响。方法选取健康成年人,抽取外周血,分离单核细胞,经贴壁获得树突状细胞前体,在体外先后加入GM-CSF、rhIL-4和(或)肿瘤抗原、LPS诱导培养10 d,获得成熟DC;而未贴壁细胞经rhIL-2诱导培养,获得T淋巴细胞。实验中设置舌癌Tca8113组和对照EC9706组,每组再根据效应细胞不同分为A组:Tca8113细胞冻融抗原致敏的DC与T淋巴细胞共培养组;B组:未经致敏DC与T细胞共培养组;C组:单纯T细胞组。结果A、B、C组效应细胞对Tca8113细胞株的杀伤活性分别为(76.48±1.47)%、(50.17±3.34)%、(27.66±4.12)%。A与B组、A与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),A组效应细胞对EC9706杀伤活性为(51.18±5.31)%,与对Tca8113的杀伤活性相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论人舌癌Tca8113细胞冻融抗原能增强DC-CTL效应细胞对舌鳞癌Tca8113细胞株特异性杀伤活性。