噬菌体PF18的生物学特性及其对肺炎克雷伯菌所致小鼠全身感染疗效的初步研究

目的研究新分离噬菌体PF18的生物学特性及其对肺炎克雷伯菌所致小鼠全身感染的疗效。方法调查PF18的噬菌谱,观察其感染肺炎克雷伯菌临床株F18的噬菌斑形态。电镜下明确其形态分类。提取噬菌体PF18的基因组并进行酶切鉴定。观察PF18尾静脉注射治疗全身感染小鼠的生存状态变化。结果 PF18在F18上可形成直径约为5mm完全透明且周围有晕环的噬菌斑,电镜显示其属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。PF18感染F18的潜伏期为17min,爆发量约为200PFU/细胞。PF18的基因组可被EcoRI、BamHI两种限制性内切酶降解,但不能被HindⅢ,kpnI降解。PF18治疗组小鼠1d内生存率为100%,1周内生存率可达30%,而无治疗对照组小鼠1d能全部死亡,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PF18潜伏期短,爆发量大,且治疗肺炎克雷伯菌所致小鼠的全身感染有一定疗效,有望作为对抗多重耐药肺炎克雷伯菌感染的生物抗菌剂,应对PF18进行深入研究。

沙雷菌裂解性噬菌体PS2生物学特性及其全基因组测序

目的明确一株粘质沙雷菌裂解性噬菌体PS2的生物学特性及全基因组序列。方法电镜观察PS2的形态;双层平板法分析PS2噬菌谱、生长曲线及理化稳定性;采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取噬菌体基因组,酶解作用鉴定基因组类型;构建噬菌体PS2测序文库,采用MiSeqTM系统测序,Velvet 1.2.08进行序列拼接。结果 PS2为肌尾型噬菌体。其感染S2菌株的潜伏期为21min,爆发量为70PFU。PS2在pH5到pH10的环境中具有较好的稳定性,在50℃和60℃的环境中活性也无明显变化。PS2基因组为双链DNA,全长167 266bp,平均GC含量为41.7%,共预测到276个ORF。BLASTN初步比对结果提示其与多株T4-like噬菌体基因组核酸序列具有显著相似性。结论分离鉴定了一株粘质沙雷菌属噬菌体,进行了生物学特性、全基因组测序和生物信息学初步分析,为噬菌体治疗多重耐药细菌及噬菌体生物信息学深入分析奠定了基础。

一株新型肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体Pdz533的生物学特性及全基因组分析

目的分析1株新型可裂解高黏液表型肺炎克雷伯菌及耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的噬菌体Pdz533的生物学特性及全基因组信息。方法以留置导尿管尿液中的肺炎克雷伯菌Fb533为宿主菌,从市政污水中分离噬菌体Pdz533,观察其噬菌斑形态,电镜下观察噬菌体的形态结构;分析其噬菌谱、一步生长曲线以及理化稳定性。应用蛋白酶K/SDS法提取噬菌体Pdz533全基因组,对其进行全基因组测序、拼装;对全基因组中可能存在的开放读码框进行预测;基于其保守蛋白构建进化树,进行比较基因组学分析。结果分离的Pdz533可裂解耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌及高黏液表型肺炎克雷伯菌,该噬菌体在宿主菌Fb533菌苔上形成直径5~8 mm的透明噬菌斑,外周有宽1 mm的半透明晕环。电镜观察Pdz533具有二十面体头部和较短的非收缩性尾部。一步生长曲线显示Pdz533感染Fb533的潜伏期约10 min,裂解量约40 PFU/cell。Pdz533在一个较宽的pH范围内(6~10)和较高的温度下(50℃)活性仍能保持稳定。Pdz533基因组全长40416 bp,(G+C)摩尔百分比含量为52.9%,预测含有50个开放阅读框。噬菌体全基因组共线性分析显示Pdz533与Autographiviridae科Studiervirinae亚科Przondovirus属噬菌体有相似的保守框架。噬菌体保守蛋白进化树表明,Pdz533为Przondovirus属的一个新成员。结论分离鉴定了1株新的裂解肺炎克雷伯菌噬菌体,为Przondovirus属的一个新成员。该噬菌体具有一定的酸碱耐受和温度耐受性,可望用于预防和治疗具有高黏液表型及耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的感染。

克雷伯菌属噬菌体LH-01的生物学特性及其对败血症小鼠疗效的初步研究

目的自地下生活污水中分离肺炎克雷伯菌的噬菌体,明确其生物学特性,观察其对小鼠多重耐药肺炎克雷伯菌所致败血症的疗效。方法电镜观察LH-01形态,调查其噬菌谱、生长曲线等生物学特性。建立小鼠败血症感染模型,观察LH-01的疗效。结果 LH-01在其宿主菌的菌苔上形成毒性噬菌体所具有的完全透明的噬菌斑,电镜观察LH-01具典型的有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的形态特征。一步生长曲线显示LH-01的潜伏期约为10min,裂解量约为100PFU/细胞。稳定性试验显示LH-01在pH 5~10及50℃和60℃环境均具良好稳定性。LH-01治疗克雷伯菌感染败血症小鼠的存活率为90%,对照组存活率为0,差异有统计学意义（P〈0.001）,且无毒副作用。结论 LH-01具有高效的裂菌活性和高稳定性,治疗克雷伯菌感染小鼠败血症有效且安全,有望成为生物抗菌剂,其有效成分有待进一步研究。

阴沟肠杆菌裂解性噬菌体Pyg1生物学特性及补体对其杀菌作用的研究

目的明确阴沟肠杆菌噬菌体Pyg1的生物学特性及补体对其杀菌作用的影响。方法电镜观察Pyg1形态,分析Pyg1噬菌谱、生长曲线及理化稳定性;比较Pyg1在不同补体活性血清中与阴沟肠杆菌临床分离株YG7作用1h后存活的细菌数。结果 Pyg1为肌尾型噬菌体,其感染YG7的潜伏期为20min,爆发量为100PFU/cell。Pyg1在pH5～9的环境中具有较好的稳定性,在50℃的环境中活性也无明显变化。Pyg1在56℃、30min热灭活的鼠血清中和在营养肉汤中均具较强的杀菌能力（P〉0.05）,存活细菌数〈100CFU/ml。但在新鲜未灭活鼠血清和补体活性为25U/ml的液体中对YG7的杀菌能力减弱,存活细菌数〉105 CFU/ml。当补体活性超过50 U/ml时,Pyg1完全失去对YG7的抗菌活性,存活细菌数与无噬菌体对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,均达107 CFU/ml以上。结论Pyg1是一株裂解性噬菌体,在自然条件下其杀菌作用强且稳定,故在减少医院环境中对其敏感的多重耐药阴沟肠杆菌方面有潜在的应用前景。但因Pyg1对YG7的杀菌作用受血清中不耐热物质补体的干扰,因此不适于治疗YG7引起的全身感染。

肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组初步研究

目的研究肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组性质。方法观察LH-02的噬菌斑形态和电镜下形态;调查LH-02的噬菌谱,并观察其一步生长曲线以及理化稳定性;提取噬菌体基因组进行酶切鉴定。结果LH-02在宿主菌KF29菌苔上形成直径2~3mm的透明噬菌斑,外周有宽2~3mm的半透明晕环;电镜观察确定其为有尾噬菌体目,短尾噬菌体科;一步生长曲线显示LH-02感染KF29的潜伏期短（约15min）,裂解量大（约217PFU/细胞）;LH-02在一个较宽的pH范围内（5~10）和较高的温度（50℃）范围内活性稳定;LH-02的核酸可被KpnⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ降解,但不能被BamHⅠ降解。结论 LH-02为裂解性噬菌体,基因组为双链DNA,其潜伏期短,裂解量大,稳定性好,有望成为生物抗菌剂。

粘质沙雷菌毒性噬菌体PS4的生物学特性及其在小鼠血清中的杀菌作用研究

目的研究粘质沙雷菌毒性噬菌体PS4的生物学特性及其在小鼠血清中的抗菌活性。方法观察PS4的噬菌斑及电镜下形态;测定PS4的噬菌谱、生长曲线及其理化稳定性,PS4在营养肉汤培养基、新鲜小鼠血清和灭活小鼠血清中的杀菌作用,以及小鼠血清中影响PS4杀菌能力影响因素。结果 PS4为长尾型噬菌体,在以粘质沙雷菌临床株S4为指示菌时,PS4可形成直径为1-1.5mm完全透明噬菌斑,其感染S4的潜伏期为10min,暴发量约为100PFU/cell,且S4对PS4的抗性突变率仅为10-7。PS4在pH 5-10的环境中具有较好的稳定性,在50℃的环境中仍能长时间保持活力。PS4在新鲜未灭活血清中对S4不具杀菌能力,但在56℃热灭活30min的鼠血清中以及在营养肉汤中的杀菌率均达99.99%,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PS4具有一定的酸碱稳定性和热稳定性,有望用于医院环境＂消毒＂,以减少多重耐药粘质沙雷菌所致的院内感染的发生。但因其杀菌作用受血清中不耐热成分的严重干扰,故不能用于治疗由S4引起的小鼠全身感染。

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ2生物学特性研究

目的研究鲍曼不动杆菌裂解性噬菌体ZZ2的生物学特性。方法电镜观察ZZ2形态，并研究其噬菌谱、生长曲线及稳定性等生物学特性。结果ZZ2可在3株鲍曼不动杆菌（AB09V，AB0901，AB0904）菌苔上形成裂解性噬菌体所具有的完全透明的滴斑区，其中AB09V是其最敏感的宿主菌。电镜观察ZZ2具典型的有尾噬菌体目肌尾病毒科病毒的形态特征；一步生长曲线显示ZZ2感染AB09V的潜伏期为12min，裂解量为（191±5）PFU／细胞。稳定性试验显示ZZ2在pH4～9及50℃和60℃环境均具良好稳定性。结论噬菌体ZZ2能杀灭鲍曼不动杆菌，可作为生物抗菌剂使用。

铜绿假单胞菌宽谱噬菌体PL39生物学特性研究

目的了解铜绿假单胞菌噬菌体PL39的生物学特性。方法观察PL39的噬菌斑形态及其病毒颗粒在电镜下的形态,分析PL39的噬菌谱、一步生长曲线、理化稳定性;提取PL39的基因组,酶切鉴定其核酸类型,并估算其基因组的大小。结果 PL39属肌尾型噬菌体,在铜绿假单胞菌临床株L39的菌苔上可形成直径为2mm的完全透明噬菌斑,可裂解66%(33/50)的铜绿假单胞菌临床株,其中PL39感染菌株L39的潜伏期约15min,裂解量约为20PFU/细胞,L39对PL39的抗性突变率为10-7,PL39在pH 3和pH 9以及60℃的极端环境稳定性良好。PL39的基因组为双链DNA,限制性内切酶图谱分析表明,其基因组含有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,初步推算基因组>100kb。结论PL39为专性裂解假单胞菌的宽谱裂解性噬菌体,具有较宽的宿主谱和理化稳定性,可用于治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染。

近交系小鼠微卫星位点的遗传标记多态性研究

目的研究近交系小鼠微卫星位点的遗传标记多态性及其意义。方法随机选取不同染色体的5个微卫星位点,应用PCR技术对BALB/C、豫医无毛小鼠、CBA、C57、DBA/2、C3H/HeJ、FVB/NJ及昆明小鼠共八种小鼠的DNA多态性进行研究。结果5对引物在近交系小鼠各基因座上均出现一条清晰的带,D16m it4、D3m it17、D3m it18具有多态性,D4m it2、D2Nds3不具有多态性。结论筛选出的引物D16m it4、D3m it17、D3m it18可用于检测近交系小鼠的品系来源和遗传背景,且所检测的小鼠符合近交要求。

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37的克隆表达

目的为进一步了解噬菌体与宿主菌之间的相互作用机制,对鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1受体结合蛋白gp37进行克隆表达。方法原核表达噬菌体ZZ1重组受体结合蛋白gp37,从分子质量、抗原性以及对ZZ1吸附竞争干扰的功能等对表达的重组受体结合蛋白gp37进行鉴定。结果PCR扩增ZZ1gp37基因后,成功诱导表达了含6×His标签的ZZ1重组受体结合蛋白gp37,SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为140×10^(3);使用0.5 mmol/L IPTG 16℃诱导过夜较37℃诱导4 h,蛋白可溶性表达增多;Western blot显示纯化蛋白可分别被his标签抗体和小鼠抗ZZ1多克隆抗体识别;竞争吸附试验显示,在重组ZZ1gp37蛋白存在的情况下,ZZ1对鲍曼不动杆菌AB09V的吸附效率与对照组的63.5%相比下降39.5%。结论成功表达了噬菌体ZZ1的重组受体结合蛋白gp37,蛋白的分子质量、反应原性以及对ZZ1吸附的竞争干扰作用均符合预期,为噬菌体ZZ1与宿主菌相互作用机制研究奠定了基础。

噬菌体LH-01治疗不同宿主菌所致小鼠致死性败血症影响因素研究

目的观察肺炎克雷伯菌噬菌体LH-01治疗不同宿主菌所致小鼠败血症的效果,分析影响疗效因素,探索评价噬菌体疗效的方法。方法通过比较噬菌斑和成斑率,从9株LH-01宿主菌中选择对其敏感性较强的菌株。尾静脉注射绝对致死量的不同敏感菌致小鼠败血症,2h后通过尾静脉注射LH-01治疗并观察其疗效。比较LH-01在小鼠新鲜血清、补体热灭活血清,以及在标准补体溶血活性由低至高的溶液中对敏感菌的杀灭能力,明确引起LH-01对不同敏感菌感染组小鼠疗效差异的因素。结果 9株宿主菌中KP6、KP13、KP16和KP22在营养肉汤中对LH-01最为敏感。当小鼠全身感染致死量的这4种细菌后,LH-01的治疗可使KP6感染组小鼠生存率达90%(9/10),KP13组为30%(3/10),而KP16组和KP22组小鼠全部死亡。体外试验显示,除LH-01对KP6的作用不受补体影响外,LH-01对其余3株菌的杀灭作用均受补体影响,其中25U/ml的补体活性即可完全抑制LH-01对KP16和KP22的杀灭作用,而完全抑制对KP13的杀灭作用所需的补体活性≥50U/ml。结论补体是影响LH-01治疗小鼠肺炎克雷伯菌感染疗效的最主要原因。血清中噬菌体对致病菌的杀菌力和补体干扰杀菌的程度有助于预测噬菌体疗效,指导细菌感染的噬菌体治疗。

鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1在小鼠体内的药代动力学研究

目的研究噬菌体ZZ1对小鼠的安全性及药代动力学。方法尾静脉1次大剂量注射高浓度去内毒素ZZ1悬液,观察小鼠反应状态,检测活性ZZ1在各组织中的浓度变化及小鼠血清抗ZZ1中和抗体的效价。结果 ZZ1对实验小鼠具良好安全性和稳定性,但免疫原性强,注射后72h即可刺激产生抗ZZ1中和抗体,第4d和第16d抗体平均滴度分别为1︰8和1︰256。ZZ1在小鼠组织中的分布以脾脏浓度较高,注射后0.5h达1.2×109 PFU/ml;肺、肾浓度较低,注射后0.5h分别为4.0×107和4.1×107 PFU/ml。结论 ZZ1对实验小鼠具有良好安全性,且在体内各组织中稳定,可用于鲍曼不动杆菌AB09V感染小鼠模型的治疗研究。

6种常用消毒剂对28株噬菌体杀菌作用影响的研究

目的观察84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏和戊二醛等6种常用消毒剂对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌作用以及对28株噬菌体杀菌作用的影响。方法以上述3个菌株为指示菌,从城市污水中分离噬菌体;通过调查噬菌谱排除噬菌体克隆株,筛选出不同克隆株的毒性噬菌体;在双层培养基表面,通过观察不同消毒剂作用区域内噬菌斑形态和成斑率(EOP)的变化,分析6种消毒剂对28株噬菌体杀菌作用的影响。结果 3种指示菌对84消毒液、双氧水、苯扎溴铵和石碳酸的敏感性不同(P<0.05),其中铜绿假单胞菌对4种消毒剂均具有较强的抵抗能力。所有被调查的噬菌体中,杀菌作用不受6种消毒剂抑制的占25.0%(7/28),其余噬菌体的杀菌作用均受消毒剂的影响。6种消毒剂中苯扎溴铵对噬菌体杀菌作用的抑制效果较强,抑制率为57.1%(16/28);而戊二醛的抑制作用最弱,对28株噬菌体均无明显抑制作用。消毒剂影响噬菌体杀菌作用试验中,有20.8%(35/168)的反应受到明显抑制,明显增强的反应达50.6%(85/168),28.6%(48/168)的反应受消毒剂的影响不明显。结论 6种常用消毒剂对噬菌体杀菌作用的影响随消毒剂和噬菌体的不同而不同,28株噬菌体的杀菌作用受6种消毒剂明显抑制的仅占少数。

19株新分离噬菌体可裂解肺炎克雷伯菌临床株的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的测定19株新分离噬菌体对30株肺炎克雷伯菌临床株的噬菌谱;对噬菌体可感染菌株进行同源性分析以进一步评价其噬菌谱。方法利用滴斑法测定19株新分离噬菌体的噬菌谱;采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对噬菌体感染的菌株进行同源性分析。结果 19株新分离噬菌体的噬菌谱可覆盖67%的被调查菌株(20/30)。其中以噬菌体P13感染的菌株最多,占33%(10/30),但这些菌株的ERIC-PCR分型仅归属于2种类型:Ⅰ型和Ⅵ型;噬菌体P27感染20%(6/30)的菌株,这些菌株的ERIC-PCR分型归属于4种类型:Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅷ型。结论根据肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指纹图谱分型信息,以噬菌体P27的噬菌谱较宽,可感染4种类型亲缘关系较远的肺炎克雷伯菌临床株。

肺炎克雷伯菌短尾噬菌体LH-01药代动力学研究

目的探讨噬菌体LH-01在小鼠体内的药代动力学及其影响因素。方法观察LH-01在小鼠体内的代谢过程和LH-01中和抗体产生规律。建立小鼠败血症感染模型,使用高剂量和低剂量LH-01进行治疗,观察小鼠健康评分（0~5）,同时检测小鼠外周血和主要脏器内活菌数和噬菌体滴度变化规律。结果噬菌体LH-01在小鼠体内具有较低的清除率,活性噬菌体可在小鼠体内持续存在数天,10d后完全消失。2周时外周血LH-01中和抗体效价为1：8,5周时最高为1：1 024。用高剂量组（10^10 PFU/ml）和低价量（10^4 PFU/ml）的噬菌体LH-01尾静脉注射治疗小鼠败血症,两组组小鼠健康评分最终差异无统计学意义（P〉0.05）,最终生存率均为100%,而对照组为0%。治疗组小鼠外周血和脏器（肝脏、脾脏和肺脏）中的菌落数显著少于对照组菌落数（P〈0.01）,尤以脾脏中菌落数减少最显著。LH-01治疗中具有自我放大效应,高剂量和低剂量治疗组小鼠外周血、肝脏和肺脏中的噬菌体滴度与噬菌体对照组相比均显著升高（P〈0.01）,尤以外周血增加最为明显。结论 LH-01具有杀菌效率高、自我增殖能力强、活性维持时间长、中和抗体产生晚等良好的药代动力学特性,可试用于多重耐药肺炎克雷伯菌感染的治疗。

一种新型艰难梭菌产毒株检测试剂临床应用研究

目的通过与GeneXpert工作站检测及质谱鉴定结合的参考方法检测临床粪便标本中艰难梭菌产毒株结果的比对,评价一种液体形式即用型显色培养基检测艰难梭菌产毒株的性能。方法此研究为临床应用研究。收集2017年3至11月河南省人民医院收治的322例腹泻患者粪便标本,分别用显色培养基、GeneXpert工作站及CCFA选择性培养并质谱鉴定,以GeneXpert工作站结合质谱鉴定为参考方法,采用SPSS 13.0软件进行kappa分析,并用标准菌株考察显色培养基的检测限及抗干扰能力。结果显色培养基检测敏感度92.86%(52/60),特异度96.99%(258/266),阳性预测值86.67%(52/60),阴性预测值98.47%(258/262),kappa分析两者的一致性较好(kappa=0.874,P<0.01),显色培养基对产毒株ATCC9689的检测限为菌液浓度10^3CFU/ml,而非产毒株ATCC43593和产气荚膜梭菌ATCC13124即使0.5麦氏单位也不产生干扰。结论即用型显色培养基直接检测艰难梭菌产毒株性能与参考方法相似,且操作简单、无需厌氧培养条件,值得扩大临床研究,为基层医疗机构推广做准备。

大肠杆菌肠毒素基因突变体在乳酸菌中的表达与免疫学鉴定

目的构建表达大肠杆菌肠毒素基因突变体mlt63的乳酸菌工程菌株,为黏膜免疫佐剂研究建立重要基础。方法从前期构建的质粒p BV-mlt63中经PCR扩增mlt63基因,经双酶切将mlt63与质粒载体p NZ8110连接。用连接产物转化大肠杆菌MC1061菌株,从重组菌株中提取p NZ8110-mlt63,用于电转化Lactococcus lactis NZ3900菌株;经质粒双酶切和测序,鉴定重组菌株L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63。采用nisin诱导重组乳酸菌表达m LT63,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 mlt63 PCR扩增产物长度与预期相符;重组菌株鉴定结果显示L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63构建正确;Western blot分析在重组菌株中检出2条mlt63表达的蛋白带,分子量分别为10 k D和40 k D。结论本研究首次将mlt63基因克隆至乳酸乳球菌中,并表达出具有抗原活性的蛋白,鉴于目前亟需安全有效的黏膜免疫佐剂,本研究发现将对该领域研究产生重要影响,对胃肠感染性疾病口服疫苗研究具有促进作用。

幽门螺杆菌Omp11重组蛋白的表达、纯化和抗原活性鉴定

幽门螺杆菌（Hp）外膜（outer membrane）是革兰阴性细菌表面的一种连续性结构,其作为免疫攻击的潜在靶标在人体保护性免疫反应中具有重要的作用.