慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究

目的:构建Te-t On系统调控的人源性Notch1胞内段(NICD)和EGFP融合蛋白的慢病毒真核表达载体,并探讨Notch1-EGFP在PC12细胞中的表达条件。方法:采用RT-PCR从人胎盘组织中获得NICD的cDNA,利用PCR扩增pEGFP-C1质粒中EGFP的编码序列,两者均定向克隆到pcDNA3.1(+)质粒中组成Notch1-EGFP片段,将该片段进一步酶切回收,并定向克隆到pLVX-Tigh-t puro载体获得pLVX-Notch1-EGFP。将构建好的质粒进行病毒包装并感染PC12细胞,抗性筛选2周。在不同时间点和不同浓度Dox作用下,用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测Notch1表达。结果:酶切和DNA测序均证实pLVX-Notch1-EGFP质粒构建成功。镜下可见感染后的PC12细胞在500 ng/ml Dox诱导36 h时90%以上细胞均表达EGFP。流式细胞术检测Notch1表达结果显示,随着Dox浓度增加,Notch1阳性细胞百分比逐渐增加;随着Dox诱导时间延长,Notch1阳性细胞百分比逐渐增高,到36 h时达到最高(81.5%)。结论:成功构建携带Notch1-EGFP融合蛋白的Te-t On调控的慢病毒真核表达载体,实现在PC12细胞中调控Notch1-EGFP融合蛋白的表达。

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后自噬水平的变化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化前后自噬水平的变化,进一步研究BMSCs神经分化机制。方法:原代培养大鼠BMSCs,三代后用L-DMEM(2%DMSO+200μmol/L BHA)诱导其向神经细胞分化,采用免疫细胞化学方法检测神经元特异标记物NSE表达,采用RT-PCR方法检测自噬相关基因LC3B、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg10的表达,用Western blot及流式细胞术检测了自噬标志蛋白LC3B的表达。结果:大鼠BMSCs传3代后,贴壁的BMSCs可达90%以上,类成纤维细胞样梭形生长,经诱导剂作用5 h后,细胞呈现神经细胞样改变,NSE阳性率为(83±5)%。RT-PCR结果表明BMSCs向神经细胞分化后LC3B,Beclin1,Atg5,Atg7,Atg10的表达升高,流式细胞术检测LC3B的平均荧光强度升高,Western blot结果表明神经分化后LC3B-Ⅱ表达增加。结论:大鼠BMSCs向神经细胞分化后自噬水平增加。

维甲酸诱导大鼠胚胎脑神经干细胞P450RAI基因的表达

目的 探索全反式维甲酸 (RA)对神经干细胞和分化细胞P4 5 0RAI表达的影响。 方法 从大鼠胚胎脑中分离神经干细胞 ,用EGF促进其增殖 ,再用不同浓度的RA单独处理 ,在不同时间用RT PCR测定神经干细胞及分化细胞的P4 5 0RAI表达水平。 结果 1μmol LRA处理神经干细胞 ,P4 5 0RAImRNA水平最高。 1μmol L时2h就可检测到神经干细胞P4 5 0RAImRNA的生成 ,4～ 12h达到高峰 ,随后迅速下降 ,2 4h几乎检测不到P4 5 0RAImRNA。间断给予RA ,P4 5 0RAI的表达随之下降。在EGF诱导生成的分化细胞中无P4 5 0RAI表达 ,而在RA处理的分化细胞中有少量表达。 结论 神经干细胞表达P4 5 0RAI对RA有浓度依赖性并需要RA的持续存在 ,随着神经干细胞分化为神经细胞 。

临床抗感染决策对NICU新生儿败血症心肌损害的影响

目的研究临床首选不同抗生素的抗感染决策对NICU新生儿败血症心肌损害发生率的影响。方法采用前瞻性临床研究方法，分析了入住NICU的112例新生儿败血症患儿心肌损害的发生率与首选不同的抗生素及其抗感染治疗效果的关系。结果治疗有效者88例，心肌损害的发生率为43％，显著低于无效者（79％，P〈0．05）。抗感染疗效差，5d内需更换抗生素者心肌损害的发生率显著高于不需更换者（P〈0．05）。头孢地嗪（CDZ）组43例，心肌损害的发生率为33％，显著低于首选其他抗生素组，即复方抗生素组和单方抗生素组（70％，56％，P〈0．05）。结论尽早选择安全、有效的抗生素，减少抗生素的更换率，可降低新生儿败血症心肌损害的发生率。CDZ治疗新生儿败血症临床疗效好。