姜黄素阻断NF-κB信号通路促进食管鳞癌细胞凋亡的体外研究

背景与目的:活化的核转录因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。但在食管鳞癌中的作用尚不清楚。姜黄素具有抗感染、抗氧化等多种药理作用。本研究将探讨姜黄素是否能够通过阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、抗凋亡产生影响。方法:Western blot法检测EC9706和Eca109细胞中加入姜黄素(50μmol/L)培养不同时间后,pIκBα和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。在EC9706和Eca109细胞中加入姜黄素培养72h,流式细胞仪检测凋亡细胞情况。MTT法检测姜黄素单独或与5-FU联合对细胞增殖的影响。结果:Western blot的结果显示,在姜黄素作用下EC9706和Eca109细胞中pIκBα和Bcl-2蛋白的表达水平随着时间的延长逐渐下降。在单独使用姜黄素后,就可促进EC9706和Eca109细胞的凋亡(P<0.05);当与5-FU联合使用时,可明显提高EC9706和Eca109细胞对化疗药物的敏感性,凋亡细胞显著增加(P<0.05)。姜黄素与5-FU联合应用48h和72h,可明显抑制EC9706和Eca109细胞的增殖,与单独使用姜黄素或5-FU组相比,细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:姜黄素可以通过抑制IκBα的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加细胞对5-FU的敏感性。

新型生物反应器——杜氏盐藻研究进展

转基因植物作为生物反应器生产外源物质已成为基因工程领域的研究热点之一 ,而杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)作为新型生物反应器生产外源蛋白具有独特的优点 ,就盐藻这一生物反应器的特点、存在问题和开发应用前景等的最近研究进展作一简要综述。

假交替单胞菌及其胞外生物活性物质研究进展

假交替单胞菌是新建立的一个海洋细菌属,它独特的生物学特性引起了越来越多研究者的关注。简介了假交替单胞菌的分类地位、生态分布等特点,重点阐述了假交替单胞菌生物活性物质的种类及其生物活性,最后对假交替单胞菌的应用前景进行了展望。

hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察

目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体 ,筛选携带该载体的包装细胞 ,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度 ,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 )并经RT PCR方法鉴定。然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态 ,MTT法研究细胞生长特性 ,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力。结果 :包装细胞产生的病毒滴度可达 2× 1 0 3 cfu·ml-1 。SKOV3/tk细胞扩增出 770bp的tk基因片段 ,形态与SKOV3细胞无明显差异 ;倍增时间 72h ,无明显变化 ;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降。结论 :hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体构建成功 ;

雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

[目的]研究雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。[方法]采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子(p70S6K)在两细胞系中的表达,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA水平及蛋白水平测定此通路的活性。[结果]mTOR在两种细胞系中均有表达,且在EC9706中的表达水平明显高于Eca109,mTOR下游靶点(p706S6K)的磷酸化水平也是EC9706明显高。[结论]mTOR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度越低,通路的激活水平越高。

Shh和Ptch在食管鳞状细胞癌中的表达研究

目的探讨食管鳞状细胞癌中Shh和Ptch的表达及其意义。方法应用免疫组织化学方法检测35例食管癌及癌旁组织中Shh和Ptch的表达情况。结果食管鳞癌中Shh和Ptch的表达阳性率分别为74.3%和68.6%,与正常组织相比Shh和Ptch在食管鳞癌组织中高表达。结论Shh和Ptch的高表达及Hh通路的激活参与了食管鳞癌的发生,可能是食管癌治疗的一个理想靶标。

转基因微藻作为新型生物反应器的研究进展

转基因微藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。目前以转基因微藻作为生物反应器的技术并不十分成熟,然而许多科研人员及生物医药公司将微藻作为新型生物反应器生产有用的外源蛋白。本文对微藻生物反应器构建中的有效核转化方法的建立、转基因微藻中所用的启动子、筛选标记、稳定表达等问题进行了综述,同时介绍了目前转化成功的以及未来可能转化成功的有潜在应用价值的微藻。

肝细胞癌中差异表达的表达序列标签的生物信息学分析

目的:采用生物信息学方法分析、预测在原发性肝细胞癌(HCC)中差异表达的表达序列标签(EST)的结构与功能,指导实验研究。方法:应用Blastn、SequencherTM、ORF Finder和DNASIS等软件分析肝细胞癌中差异表达的EST的全长、开放读码框、电子表达谱、染色体定位和编码蛋白质的功能。结果:获得2条新的cDNA全长序列;2条EST分别定位于2p13～15、3p14;高表达EST主要表达于肿瘤组织,低表达EST主要表达于正常组织;高表达基因编码蛋白质参与细胞信号转导、前mRNA加工和细胞骨架组装,低表达基因编码蛋白质与机体T淋巴细胞介导的免疫反应有关。结论:生物信息学技术有助于高效、快速地克隆、鉴定新基因。

PSMD7基因在人食管鳞癌组织中的表达及影响癌细胞增殖、凋亡的机制研究

背景与目的:26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基7(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7,PSMD7)作为组成19S蛋白酶体盖子结构的核心成员是否参与肿瘤的发生、发展,以及具体的分子机制尚不清楚。本实验将研究PSMD7基因在人食管鳞癌组织中的表达,以及对癌细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测食管鳞癌及其癌旁正常组织标本中PSMD7的mRNA及蛋白表达情况。在人食管鳞癌细胞系TE-1中,用慢病毒介导的RNA干扰技术下调PSMD7的表达,观察细胞增殖及凋亡的变化,检测线粒体膜电位的变化、细胞质中Cyt C的表达以及凋亡相关因子的表达。结果:PSMD7基因的mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.05),PSMD7蛋白的高表达与淋巴结转移阳性呈正相关(P<0.05)。抑制PSMD7蛋白的表达可使细胞的增殖能力降低(P<0.05),并促进细胞的凋亡(P<0.05),同时线粒体膜电位降低,促进Cyt C释放进入细胞质,激活caspase级联反应,说明抑制PSMD7的表达诱导细胞凋亡是通过线粒体信号通路进行的。结论:PSMD7在食管鳞癌中呈高表达,并通过线粒体依赖的方式促进TE-1细胞凋亡。

NF-κB信号通路在食管鳞癌细胞系中的激活

目的核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究拟通过检测NF-κB信号通路在食管鳞癌细胞系中是否存在,分析NF-κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其对食管鳞癌细胞的生存及转化作用。方法采用免疫细胞化学法和Western blotting法检测两株食管鳞癌细胞系中NF-κB亚单位p50和p65,阻遏物IκBα及其上游激酶IKKβ的蛋白表达。并采用EMSA法检测两株食管鳞癌细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果食管鳞癌细胞中存在激活的NF-κB信号通路,p50、p65、IκBα及其上游激酶IKKβ的蛋白在细胞质中均表达,并且p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性。结论本研究发现NF-κB信号通路在两种食管鳞癌细胞系被激活,提示激活的NF-κB信号通路可能在食管鳞癌发生中起重要作用。

核基质结合区提高稳定整合的CAT报告基因在NIH3T3细胞中的表达

通过PCR从人基因组扩增β珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)及β干扰素MAR,正向及反向克隆至pCAT3载体SV40启动子的上游,分别检测瞬时及稳定表达的情况下MAR在NIH3T3细胞内对CAT报告基因的影响情况。结果显示:瞬时表达情况下,反向及正向插入的MAR均不能提高CAT基因的表达;稳定整合的情况下,插入的β珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,β干扰素MAR提高3倍,反向及正向插入的MAR没有明显的差别。这表明MAR能在一定程度上提高外源基因的表达水平,并且不同的MAR对外源基因表达的影响存在差异,MAR的插入方向对外源基因的表达水平没有明显的作用。

大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定。结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系。成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系。

siRNA阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、耐药的影响

目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白的表达;MTT法检测转染NF-κBp65siRNA24h、48h、72h后Eca109和EC9706细胞的增殖情况及转染同时联合应用不同质量浓度5-Fu(0mg/L,16.35mg/L,32.7mg/L,327mg/L,3270mg/L,6540mg/L)对Eca109和EC9706细胞增殖的影响。结果:①NF-κB亚单位p65在Eca109和EC9706细胞质中高表达,p65siRNA可有效阻断p65蛋白表达。②MTT实验表明,转染组细胞存活率较未转染组明显下降(P<0.05);与化疗药5-Fu联用,转染组和未转染组细胞的增殖活性随着5-Fu浓度的增加有下降趋势,但在同一浓度,转染p65siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05)。结论:应用RNAi技术可有效干扰p65的表达,抑制食管鳞癌细胞的增殖,增强对化疗药5-Fu的敏感性。因此,可将阻断NF-κB信号通路作为基因治疗的靶点。

食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBα的mRNA、蛋白表达

目的:核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究通过检测食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBαmRNA、蛋白的表达及NF-κB的DNA结合活性,分析NF-κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其在食管鳞癌细胞的生存及转化中的作用。方法:采用West-ernblotting法检测两株食管鳞癌细胞胞质中NF-κB亚单位p50和p65、阻遏物IκBα及其磷酸化IκBα的蛋白表达,检测细胞核中p50和p65的蛋白表达并采用EMSA法检测其与DNA的结合活性。使用RT-PCR法检测p50、p65、IκBαmRNA的表达。结果:NF-κB的亚单位p50、p65、IκBα及磷酸化IκBα在食管鳞癌细胞质中均表达,p50、p65蛋白在细胞核中也表达并具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50、p65、IκBα的mRNA在细胞中也存在过表达。结论:本研究发现NF-κB在两株食管鳞癌细胞系中被激活,基因的过表达及IκBα的磷酸化在维持NF-κB的活化中起着重要的作用。

EC9706和Eca109细胞中雷帕霉素靶蛋白信号通路激活状态观察

目的:观察低分化的食管鳞癌细胞EC9706和高分化的食管鳞癌细胞Eca109中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的激活状态。方法:采用细胞免疫组织化学方法检测EC9706和Eca109细胞中mTOR及其下游靶分子p70S6K的表达和定位,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA及蛋白水平检测此通路的活性。结果:在2种细胞中mTOR均有表达,且在EC9706细胞中的表达水平高于Eca109(P<0.05);EC9706细胞中mTOR下游靶点的磷酸化水平高于Eca109细胞(P<0.05)。结论:在2种食管鳞癌细胞中,mTOR信号通路均特异性激活;但激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度低者通路的激活水平较高。

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位

为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及N端和C端融合蛋白成功在CHO细胞表达,MBP和C端部分定位于细胞核且聚集于核仁,N端部分分布整个细胞,说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号位于C端,MBP可能与rRNA前体结合发挥作用。

siRNA阻断NF-κB信号通路联合5-FU对食管鳞癌细胞凋亡的促进作用

目的:利用RNAi技术特异性的抑制NF-κB亚单位p65的表达,观察其对p65表达的抑制作用及联合5-FU对食管鳞癌细胞Eca109和EC9706的影响.方法:将终浓度为50nmol/L的p65 siRNA转染到食管鳞癌细胞EC9706和Eca109中,通过RT-PCR检测0、24、48和72h时段p65 mRNA的表达水平.Western blotting法检测p65和Bcl-2蛋白表达,AnnexinV/PI复染结合流式细胞仪检测细胞凋亡,显微镜下观察p65siRNA与5-FU单独或联合应用对食管鳞癌细胞形态学特性的影响.结果:EC9706和Eca109细胞转染p65 siRNA24、48和72h后,p65 mRNA的表达水平随时间的延长逐渐下调,在72h的阻断效率最为明显,与0h相比,差异有显著性(0.12±0.01vs0.28±0.05,0.1±0.01vs0.38±0.04,均P<0.05),转染72h后,p65和Bcl-2蛋白表达水平下调.EC9706和Eca109转染p65 siRNA后,细胞凋亡指数明显升高(6.65%±0.27%vs2.03%±0.08%,8.03%±0.06%vs2.66%±0.25%,均P<0.05);p65siRNA转染72h后,EC9706和Eca109细胞增殖较慢;当p65 siRNA与5-FU联合作用,细胞增殖明显受到抑制.结论:p65 siRNA可阻断NF-κB信号通路,下调NF-κB下游基因中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,表明活化的NF-κB信号通路可成为食管鳞癌基因治疗中一个重要的分子靶点.

HeLa细胞系中核转录因子-κB与Bcl-2的表达

目的:分析宫颈鳞癌HeLa229细胞中核转录因子(NF-κB)的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl-2表达的相关性。方法:采用免疫细胞化学法和Western Blot法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中NF-κB亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl-2的蛋白表达,RT-PCR法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中p50和p65 mRNA的表达。EMSA法检测HeLa229细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果:宫颈鳞癌HeLa229细胞质中NF-κB的亚单位p50和p65均有表达,p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50和p65的mRNA在细胞质中也存在表达,并且在HeLa229细胞中也检测到Bcl-2蛋白的表达。结论:在宫颈鳞癌HeLa229细胞中存在有NF-κB及其下游基因Bcl-2的表达,提示激活的NF-κB信号通路可能在宫颈鳞癌发生发展及抗凋亡中起重要作用。

p65 siRNA联合顺铂对宫颈癌HeLa229细胞增殖及侵袭力的影响

目的通过RNA干扰(RNAi)阻断宫颈癌细胞HeLa229中核因子(NF)-κB信号通路,观察其单独或与顺铂(DDP)联合对HeLa229增殖、耐药性和侵袭力的影响。方法利用RNAi技术,将HeLa229分为未转染组(A组)和转染p65小干扰RNA(siRNA)组(B组),用MTT法检测转染p65 siRNA 24、48、72 h时HeLa229的增殖情况;加入不同浓度DDP,观察其对HeLa229细胞增殖的影响。用Boyden chamber体外侵袭实验检测A、B组及p65siRNA与DDP(8.6 mg/L)联合组(C组)细胞侵袭力的变化。结果B组细胞存活率较A组明显下降;加入DDP后,A、B组细胞的存活率均随DDP浓度的增加而下降。siRNA与DDP联合应用可明显提高HeLa229对DDP的敏感性。与A组相比,B、C组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P<0.05)。结论应用RNAi技术可有效阻断HeLa229内NF-κB信号通路,抑制其增殖和体外侵袭力,增强其对DDP的敏感性。

肉桂酸对人肺腺癌A549细胞相关基因表达的影响

目的探讨肉桂酸(C INN)诱导肺癌A 549细胞分化的能力及其分子机制。方法采用原位杂交和完整细胞原位斑点印迹等技术,研究C INN对人肺腺癌A 549细胞分化相关蛋白质分子CD 15,相关基因c-m yc、EGFR、w tp53、w tp16等表达的影响。结果C INN可上调w tp53、w tp16基因,抑制CD 15、c-m yc、EGFR基因表达。结论C INN的上述作用可能是其诱导肺癌A 549细胞分化的机制之一。