肝细胞生长因子对ALL小鼠骨髓移植后GVHD和血清Th1/Th2相关细胞因子的影响

为了观察肝细胞生长因子 (HGF)对急性淋巴细胞白血病 (ALL)小鼠异基因骨髓移植 (allo BMT)后GVHD和血清Th1 Th2相关细胞因子的影响 ,BALB c小鼠ALL模型建立后 ,接受 11Gy全身照射 ,将昆明小鼠骨髓移植给该ALL模型小鼠。随机将BALB c小鼠分A、B两组 ,A组移植后 0天至 7天皮下注射HGF ,B组皮下注射PBS。移植后观察A、B两组的GVHD症状和肝、小肠、皮肤的病理学变化 ;移植后第 8天取血检测IFN γ和IL 4水平。结果表明 :A组的GVHD症状积分低于B组 (P <0 .0 5 ) ;A、B两组的IFN γ均高于正常组 (P值分别 <0 0 5和0 0 0 1) ,但A组低于B组 (P <0 .0 1) ;A、B两组的IL 4均低于正常组 (P <0 .0 5 ) ,而A组的IL 4高于B组 (P <0 .0 5 )。结论 :HGF可减轻GVHD的严重程度 ,与HGF有调节Th1 Th2相关细胞因子趋于平衡的作用有关。

血管内皮细胞生长因子基因治疗严重肢体缺血

观察缺血肢体肌肉内注射编码血管内皮细胞生长因子的裸露质粒的安全性、可行性及有效性。对 3例(4条肢体 )严重肢体缺血患者在肢体缺血部位随机选择 4个位点 ,注射编码血管内皮细胞生长因子 16 5的真核表达质粒pUC CAGGS/h血管内皮细胞生长因子 16 5 4mg ,每两周注射一次。肌肉内注射裸露质粒后每天观察患者的临床情况。治疗后 1～ 3个月重复血管造影以观察有无新生血管的形成。结果发现缺血性溃疡愈合或明显改善 ,静息性疼痛缓解 ,血管造影发现有新生血管形成和侧枝循环的建立。所有患者均在治疗后出现一过性下肢水肿 ,一周内自然消退 ,水肿的出现与血管内皮细胞生长因子增加血管通透性相一致。结果提示 ,肌肉内注射编码血管内皮细胞生长因子 16 5的裸露质粒DNA可诱导严重肢体缺血患者的治疗性血管生成 ,是一种安全有效的治疗肢体缺血的方法。

环氧合酶-2抑制剂对梗阻性肾病大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响

目的:探讨环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)对梗阻性肾病大鼠模型肾组织结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响及机制。方法:采用单侧输尿管结扎(UUO)建立梗阻性肾病模型,并随机分为模型组和治疗组,另设假手术组作对照。治疗组每日给予塞来昔布100mg/kg,模型组、假手术组每日给予等体积的生理盐水于造模前1d至造模后14d灌胃,分别于UUO后3d、7d、14d分批处死,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β1、CTGF的基因表达,免疫组化技术检测TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN的蛋白表达,放免法检测组织内cAMP的水平。结果:与假手术组相比,模型组TGF-β1、CTGF的基因表达显著上调,cAMP的水平下降(P<0.001)。塞来昔布对梗阻肾TGF-β1的表达无显著改变,但能升高组织内cAMP水平,抑制CTGF的表达,纤维化程度减轻。结论:在梗阻性肾病大鼠中TGF-β1、CTGF的表达均显著升高,选择性COX-2抑制剂通过升高组织内clip的水平来抑制TGF-B的下游因子———TGF的表达延缓肾间质纤维化。

骨骼肌卫星细胞纯化及培养的实验研究

目的:建立一种骨骼肌卫星细胞纯化及培养方法。方法:取成年雌性SD大鼠前肢肱三头肌,用胶原酶和Dispase进行消化,采用差速贴壁的方法纯化骨骼肌卫星细胞,用含20%胎牛血清的Hams-F10培养基进行培养,α-骨骼肌肌动蛋白(α-sarcometricactin)免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果:成功地分离培养了成年大白鼠的骨骼肌卫星细胞。结论:采用差速贴壁的方法可以成功纯化骨骼肌卫星细胞,为将来自体肌卫星细胞移植治疗压力性尿失禁打下了基础。

骨髓基质干细胞的分离纯化及培养

目的 建立骨髓基质干细胞(MSCs)良好的分离纯化和培养方法。方法 将小鼠骨髓基质干细胞自股骨中分离,应用贴壁选择法结合细胞克隆挑选法进行分离纯化,应用细胞生长因子(EGF和PDGF-BB)刺激法进行MSCs的体外培养和传代,倒置显微镜下观察分离培养的细胞并照像记录。结果,培养获得了纯化的呈梭形成纤维样细胞的骨髓基质干细胞。在生长因子EGF和PDGF-BB的共同作用下,传代MSCs生长旺盛,形态均一。结论 该方法是简便高效的骨髓基质干细胞的分离纯化和培养方法。

动脉再生机制研究:骨髓间充质干细胞诱导分化内皮样细胞的体外实验

目的:探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮样细胞定向分化条件。方法:无菌条件下采集兔骨髓,肝素抗凝,经淋巴细胞分层液(相对密度为1.077)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,通过贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞(bonemarrow-mesenchymalstemcell,MSC),然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化,观察细胞的体外生长特点及其生化特性。结果:MSC每扩增一代,细胞数量增加5～8倍,7.65×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.26×108个细胞。特定条件下贴壁细胞延展呈梭形,形成细胞簇、索状结构及“铺路石”样结构,扩增细胞免疫组化证实表达CD31和VIII因子相关抗原(factorVIIIrelatedantigenvonWille-brandfactor,vWF),具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白的功能。结论:MSC扩增能力强,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。

磷酯酰肌醇3激酶抑制剂对碱性成纤维细胞生长因子诱导的平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的：研究磷酯酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂Wortmannin（WT）对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响，为探讨bFGF诱导平滑肌细胞增殖和迁移的信号通路提供实验依据。方法：采用细胞计数、划痕损伤实验和免疫印迹法，观察Wortmannin对bFGF诱导的VSMCs增殖、迁移及磷酸化Akt表达的影响。结果：干预后24h，bFGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强，同时磷酸化Akt的表达平行增高。加用Wortmannin后，明显抑制了VSMCs的增殖、迁移和磷酸化Akt的表达。结论：bFGF诱导的VSMCs增殖和迁移可能是通过PI3K／Akt信号通路发挥作用。

Dispase在成年鼠骨骼肌干细胞纯化中的价值

目的寻找一种最佳的骨骼肌干细胞分离及纯化方法。方法采用成年雌性SD大鼠,分别采用二步消化法和Dispase消化法分离肌干细胞,然后用差速贴壁技术纯化肌干细胞,骨骼肌肌动蛋白(α-sarcometricactin)免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果Dipase组肌干细胞的数量明显多于二步消化法组,且细胞的生长速度也明显较后者快,而衰老速度则明显慢于后者。结论Dipase可明显减轻细胞的损伤,提高肌干细胞的数量和质量,是一种最佳的细胞分离酶。

反义AT1R腺病毒重组体的构建及鉴定

目的 构建含人血管紧张素Ⅱ1型受体反义cDNA(AS-AT1R)的重组腺病毒载体，为AS-AT1R抗高血压及其并发症的研究。方法 用定向克隆法将人AT1RcDNA反向插入到穿梭质粒pACCMVPLPA的CMV启动子之下，获得重组质粒pAd—AS—hAT1R。后者与pJM17通过脂质体共转染293细胞，经同源重组获得含反义人AT1R基因的重组腺病毒Ad—AS—hAT1R。通过PCR共扩增法鉴定Ad—AS—hAT1R。根据260nm紫外光吸收值计算病毒滴度。结果 AT1RcDNA成功地反向插入pACCMVPLPA载体，以重组病毒DNA为模板，同时扩增出670bp的AT1RcDNA片段和860bp的腺病毒骨架基因片段，证实了Ad—AS—hAT1R的正确性。病毒滴度为0．82×10^12pfu／ml。结论 成功构建了携带反义人AT1RcDNA的腺病毒，为AS-AT1R抗高血压的治疗研究奠定了基础。

自体骨髓细胞局部移植对外周血管新生作用的影响

目的探讨自体骨髓细胞局部移植对肢体缺血的治疗作用。方法14只雄性新西兰兔结扎并离断单侧股动脉及其分支动脉1h后,骨髓细胞局部移植组(n=7)于缺血局部肌肉注射新鲜分离的自体骨髓单个核细胞悬液,对照组(n=7)局部肌肉注射磷酸盐缓冲液,分别于实验前(0d)、7d和28d进行股部血流动力学检测,于28d时处死动物做组织病理学分析。结果7d和28d时,彩色多谱勒血流显像示骨髓细胞局部移植组血流信号较对照组丰富,且收缩期峰值血流速度与舒张期流速较快(P<005),28d时血管阻力指数、血流量两组间有显著差异(P<005);病理学分析骨髓细胞局部移植组单位面积毛细血管密度显著高于对照组(P<001),毛细血管数目与肌纤维数目的比值两组间显著差异(P<005)。结论自体骨髓细胞局部移植促进外周血管新生,可能成为缺血性外周血管疾病一种新的治疗方法。

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义(英文)

目的探讨表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murinebonemarrowstromalstemcells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法。方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态。结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象。结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子。

靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞迁移的抑制作用

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以人脐静脉内皮细胞为靶细胞,设计针对Akt1基因mRNA的siRNA(siAkt1),利用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞,采用半定量PCR技术(RT-PCR)检测Akt1mRNA的表达,用Western blotting技术检测Akt总蛋白表达。同时用体外"伤口愈合"实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制内皮细胞Akt1mRNA(P<0.01)和Akt总蛋白的表达(P<0.05),A549细胞条件培养基显著促进人脐静脉内皮细胞迁移(P<0.05),但对转染siAkt1的人脐静脉内皮细胞迁移没有促进作用(P>0.05)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用,这为肺癌血管生成干预治疗提供了新的理论基础。

人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 :建立人肾小管上皮细胞原代培养、传代、冻存及鉴定方法。方法 :采用肾小管节段贴块培养法 (A法 )与消化培养法 (B法 )对比原代培养 ,并以 0 .2 5 %胰蛋白酶消化、传代 ,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类 ,常规冻存和复苏。结果 :A法成功培养、传代、冻存、复苏并鉴定了人肾小管上皮细胞 ,B法失败。结论

骨髓间充质干细胞体外分化过程中端粒酶活性表达及意义

目的 :探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞及其扩增过程中端粒酶活性的表达及其意义。方法 :联合应用密度梯度离心和贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞 ,继而诱导其向内皮细胞方向分化并传代培养。用TRAPezeELISA法和TRAP银染法分别检测骨髓间充质干细胞体外诱导分化前后端粒酶活性。结果 :兔骨髓间充质干细胞体外培养时具有快速增殖能力 ,在特定环境中诱导分化细胞具有内皮细胞特征 ;增殖前的骨髓间充质干细胞端粒酶活性低水平表达 ,一旦经过诱导分化其端粒酶活性表达上调 ,在 5代内其端粒酶活性不因细胞传代而下降或消失。结论 :骨髓间充质干细胞在体外有限扩增和诱导分化时保持端粒酶活性 ,维持组织干细胞特性 ,为内皮祖细胞的临床研究奠定理论基础。

经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病

目的 :观察经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子 (VEGF)基因转移治疗严重冠心病的疗效。方法 :2例病人均为严重弥漫性三支病变 ,临床上心绞痛为Ⅳ级 ,药物治疗效果不好 ,采用经皮冠脉内途径导入表达人VEGF16 5的腺病毒载体 (AdCMV .VEGF16 5 )。结果 :手术操作过程中 ,患者耐受良好 ,无不良反应发生。两例均在术后 1h出现一过性发热 ,持续 3h ,经处理后体温恢复正常。未发生心肌梗塞 ,心律失常 ,血流动学不稳定或心功能改变 ,随访 6周未出现与腺病毒载体有关的心脏及全身不良反应。 2例病人心绞痛症状均显著改善 (由术前每天需 18～ 2 0片消心痛至术后 3～ 6片 /d ,心绞痛分级由术前Ⅳ级提高至术后Ⅱ级 ) ,术后 45d时冠脉造影示冠脉闭塞区域心肌侧支循环增加。结论 :通过这 2例初步经验 ,提示经皮冠脉内腺病毒载体介导的VEGF16 5基因转移治疗严重冠心病可促进侧支循环形成以及临床心绞痛症状改善。

AIDS患者和HIV感染者T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义

目的: 应用流式细胞仪(Flowcytometer, FCM)检测AIDS患者和HIV感染者外周血T淋巴细胞亚群的表达和绝对计数情况。方法:应用流式细胞仪三色荧光标记和绝对计数法检测 50例正常健康成人, 12例AIDS患者, 18例HIV感染者的外周血CD3+、CD4+、CD8+的表达及绝对数量。结果:AIDS患者和HIV感染者的CD4+淋巴细胞明显比正常人低,特别是AIDS患者CD4+淋巴细胞数低于 200个 /mm3,CD8+淋巴细胞显著增高,CD4+ /CD8+比值倒置。结论:用FCM检测AIDS患者和HIV感染者的免疫状况,可作为评价AIDS病程进展的重要指标。

Wortmannin对表皮生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的:研究PI3K抑制剂Wortmannin对表皮生长因子(EGF)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响,旨在探讨EGF诱导的VSMCs增殖和迁移的信号通路。方法:以低血清培养的VSMCs作为对照,采用细胞计数、划痕损伤实验和WesternBlotting技术,观察Wortmannin对EGF诱导的VSMCs增殖、迁移及磷酸化Akt蛋白表达的影响。结果:干预后24h,EGF组VSMCs增殖、迁移较对照组明显增强,同时磷酸化Akt蛋白的表达平行增高。而Wortmannin则明显抑制了VSMCs的增殖、迁移和磷酸化Akt蛋白的表达。结论:PI3K/Akt信号通路参与了EGF诱导的VSMCs增殖和迁移。

反义VEGF165腺病毒重组体的构建及鉴定

目的 :构建含人反义血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因的重组腺病毒载体 ,为采用反义VEGF16 5RNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人VEGF16 5cDNA反向插入到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,即pAd -ahVEGF16 5。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人反义VEGF16 5基因的重组腺病毒Ad -ahVEGF16 5。通过PCR共扩增法鉴别Ad -ahVEGF16 5的正确与否。根据 2 6 0nm的紫外光吸收值计算病毒滴度。结果 :VEGF16 5cDNA成功地反向插入了pHCMVSP1A载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了5 76bp的反义VEGF16 5基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad -ahVEGF16 5的正确性。病毒滴度为5 .6× 10 11pfu/ml。结论 :成功构建了携带人反义VEGF16 5基因的腺病毒Ad -ahVEGF16 5 ,本研究为采用反义VEGFRNA途径治疗肿瘤的在体。

全反式维甲酸对培养的大鼠动脉平滑肌细胞迁移的影响

目的 :研究全反式维甲酸 (ATRA)对培养的大鼠动脉平滑肌细胞 (VSMCs)迁移的影响。方法 :血管平滑肌细胞采用组织贴块法培养 ,ATRA(2 .5× 10 -6mol/L)分别作用经PDGF -BB(2 0ng/ml)和 10 0 %FCS趋化作用下的VSMCs,采用改良的Boydenchamber方法检测VSMCs的迁移活性。结果 :ATRA作用的VSMCs对PDGF -BB和 10 0 %FCS的化学趋化活性明显减弱。结论 :ATRA具有抑制VSMCs迁移的作用。

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 。