胶质瘤来源的外泌体非编码RNA在胶质瘤中的研究进展

胶质母细胞瘤是最常见的恶性脑肿瘤,其特征是高侵袭性,高度异质性以及特殊的解剖部位。虽然免疫疗法和联合疗法发展起来了,但是恶性胶质瘤的预后仍然很差。在肿瘤微环境中,由GDEs包裹的广泛的ncRNA在胶质瘤的各种病理生理过程中发挥重要调节作用。本文总结了GDEs ncRNA在胶质瘤的增殖、侵袭、免疫调节、治疗耐药性等方面的最新研究进展。毫无疑问,对这一研究的总结将为GDEs ncRNA治疗胶质瘤的临床应用提供更全面的见解。

长链非编码RNA SNHG1对人口腔鳞状细胞癌细胞N-cadherin、MMP-9表达的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG1对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞N-cadherin、MMP-9表达的影响。方法:利用实时荧光定量PCR检测OSCC组织、癌旁组织和OSCC细胞(CAL27、HN6、SCC25)、口腔上皮角质细胞(HOK)中lncRNA SNHG1的表达量;过表达lncRNA SNHG1,将细胞分为对照组(LV-CN组)和实验组(LV-SNHG1组),分别采用CCK-8细胞计数试剂盒和细胞划痕实验检测两组细胞的增殖和迁移能力,实时定量PCR和Western blot检测两组细胞迁移和侵袭相关基因N-cadherin、MMP-9的表达情况。结果:相比于癌旁组织,OSCC组织中lncRNA SNHG1表达含量降低(P<0.01);相比于HOK,CAL27、HN6中lncRNA SNHG1表达含量降低(P<0.01),SCC25中lncRNA SNHG1的表达含量差异无统计学意义(P>0.05);过表达lncRNA SNHG1可抑制OSCC细胞CAL27增殖、迁移的能力(P<0.01),并可抑制N-cadherin、MMP-9蛋白及基因的表达含量(P<0.01)。结论:lncRNA SNHG1在OSCC组织及细胞中低表达,上调lncRNA SNHG1能有效降低OSCC细胞的侵袭和转移。

非编码RNA与糖尿病血管病变的关系

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)为一类不编码蛋白的RNA分子,是机体重要的生物调控因子,在转录及转录后水平调控基因表达,影响糖尿病血管病变的发展过程。ncRNA按其片段大小主要分为微RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)及环状RNA(circular RNA,circRNA)。miRNA可在转录后水平调控靶基因表达,并有成为临床诊断标志物的潜能。lncRNA影响多种分子信号通路,其在糖尿病血管病变中的作用逐渐受到关注。circRNA具有显著的基因调节功能,可与miRNA竞争结合位点,参与调控糖尿病血管病变。该文回顾目前有关ncRNA与糖尿病血管病变的研究,探讨ncRNA与糖尿病微血管及大血管病变间的关系,为糖尿病血管病变的诊断和治疗提供新思路。

M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1通过激活JAK2/STAT3通路促进巨噬细胞的极化

目的探究M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1对巨噬细胞极化的影响及机制。方法体外分离并培养BALB/c小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),IL-4诱导其向M2型巨噬细胞极化后,提取并鉴定M2细胞上清液所分泌的外泌体exosome(M2-exo),qRT-PCR检测M2外泌体中lncRNA的表达。将100μg/mL的M2-exo,对照组用等体积的PBS分别与M0巨噬细胞共孵育48 h后,qRT-PCR及Western blot检测各组细胞中Arg1、YM-1、FIZZ1、iNOS和TNF-α的表达,流式细胞术检测CD206^(+)细胞比例,Western blot检测各组细胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平。设计、合成lncRNA smart silencer特异性抑制lncRNA NR_028113.1的表达,转染M2细胞48 h后提取各组细胞(exo+NC和exo+smart silencer)上清液分泌的外泌体再与M0型巨噬细胞共孵育,检测孵育后各组细胞中Arg1、YM-1、FIZZ1、iNOS和TNF-α的表达以及CD206^(+)细胞比例和JAK2/STAT3信号通路蛋白磷酸化水平。结果lncRNA NR_028113.1在M2型巨噬细胞外泌体中高表达(P<0.05)。相比于PBS对照组,与M2-exo共培养的M0巨噬细胞中Arg1、YM-1和FIZZ1表达均显著上调(P<0.05),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.05),CD206^(+)细胞所占比例显著增加(P<0.01),JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05)。抑制M2-exo中lncRNA NR_028113.1的表达后,共培养的M0巨噬细胞中Arg1、YM-1和FIZZ1表达显著下调(P<0.05),iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.05),CD206^(+)细胞所占比例显著减少(P<0.05),JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平显著减少(P<0.05)。结论M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1可显著促进巨噬细胞向M2型极化,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路相关。

LncRNA SNHG9在肿瘤中的研究进展

长链非编码RNA是一类分子大小超过200个核苷酸缺乏明显的开放阅读框架不能编码蛋白质的新型转录物。随着基因组学技术的发展,越来越多的研究发现LncRNA在人类癌症中可以作为一个重要的启动肿瘤或者抑制肿瘤的信号,进而导致肿瘤的发生。小核仁RNA宿主基因9(SNHG9)是一种膜脂相关的且在肿瘤组织中有较高表达丰度的LncRNA,已被证明能通过多种信号通路轴来调控多种肿瘤(如非小细胞肺癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌以及胶质母细胞瘤等)的发生、发展和转移。本文主要就LncRNA SNHG9在肿瘤中的的研究现状进行阐述。LncRNA SNHG9可以作为治疗肿瘤的一个有效的靶点,有望成为相关肿瘤的潜在的生物标志物,来监测肿瘤患者的病情进展。

铁死亡在免疫细胞调节中的研究进展

铁死亡是由大量脂质过氧化介导的依赖铁的程序性死亡。免疫细胞可以通过清除死细胞的碎片来预防炎症和自身免疫性疾病。铁死亡与感染、炎症和肿瘤之间均存在潜在的联系。同时,免疫细胞在上述过程中起着至关重要的作用,因此探讨两者之间的关系具有重要的意义。本综述试图解释铁死亡与各种免疫细胞之间的联系,并明确铁死亡在感染、炎症和恶性肿瘤中发挥的作用,由此,可以找到这些疾病的潜在治疗靶点。

敲低IFI30通过激活STAT1抑制U251人胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡

目的 构建γ干扰素诱导蛋白30(IFI30)表达抑制的U251细胞,探讨IFI30表达受到抑制后对细胞生物学功能的影响及机制。方法 在线设计敲低靶点并合成3条小干扰RNA(siRNA),转染后通过实时定量PCR技术检测抑制效率,选取抑制效率最高的siRNA序列构建短发夹RNA (shRNA)质粒。重组质粒与包装质粒共转染HEK293T细胞制备慢病毒。用慢病毒感染胶质瘤U251细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性细胞。采用CCK-8实验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)实验和集落形成实验分析细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,Transwell^(TM)实验检测细胞侵袭、划痕实验检测细胞迁移。Western blot法检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和神经钙黏蛋白(N-cadherin)、信号转导子与转录激活子1(STAT1)。结果 筛选到有效的靶点序列并成功建立IFI30表达抑制的U251细胞。敲低IFI30的表达抑制U251细胞增殖,G0/G1期细胞比例增加,S期减少,细胞凋亡明显增加,细胞的侵袭和迁移能力降低。同时,U251细胞cyclin D1、Bcl2和N-cadherin的表达降低,E-cadherin, STAT1磷酸化表达增加。结论 敲低IFI30通过促进STAT1活化抑制U251细胞增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡。

CircPCSK5在胃癌中高表达并促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化

目的 探讨circPCSK5在胃癌中的表达情况和对胃癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的影响。方法 通过高通量测序构建胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织的circRNA差异表达谱。选取在皖南医学院第一附属医院行胃癌根治术的患者共62例作为研究对象,利用RT-qPCR检测circPCSK5在胃癌组织和细胞系中的表达情况。采用χ^(2)检验分析circPCSK5表达水平与胃癌临床病理资料相关性,利用Kaplan-Meier法绘制患者的总生存和无病生存曲线,Cox比例风险回归模型分析影响胃癌患者预后的独立危险因素。通过RNase R和actinomycin D实验检测circPCSK5的稳定性。利用荧光原位杂交和细胞核质分离实验检测circPCSK5的亚细胞定位。通过CCK-8和EdU实验检测circPCSK5对胃癌细胞增殖能力的影响,通过transwell实验检测circPCSK5对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。利用Western blot和RT-qPCR检测敲低或过表达circPCSK5后胃癌细胞上皮-间质转化标记物的表达变化。结果 在胃癌组织和细胞中,circPCSK5的表达明显升高(P<0.001,P<0.01)。CircPCSK5表达水平与患者的肿瘤大小、脉管侵犯、淋巴结转移和AJCC分期存在明显正相关性(P<0.05)。CircPCSK5高表达患者的总生存和无病生存时间明显低于circPCSK5低表达患者(P<0.001),且circPCSK5高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。敲低circPCSK5表达能明显抑制HGC27细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01),并导致上皮间质转化标记物E-cadherin表达升高,N-cadherin和Vimentin表达降低(P<0.01)。过表达circPCSK5能促进MKN45细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01),降低E-cadherin表达,升高N-cadherin和Vimentin表达(P<0.01)。结论 CircPCSK5在胃癌中高表达,并能促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化,可作为胃癌预后预测指标和潜在的分子治疗靶点。

肝细胞癌中促癌miRNA调控网络分析与验证

目的构建肝细胞癌中生存相关的促癌miRNA与其靶基因的调控网络并对关键miRNA-靶基因进行实验验证。方法利用OncomiR和Oncolnc获取肝癌中生存相关的miRNA,并进行表达分析和生存分析;利用miRNet预测miRNA的靶基因,通过GEPIA2、Ualcan分别对靶基因进行生存和表达分析,通过Starbase进行miRNA-靶基因共表达分析,利用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因网络,通过Enrichr进行靶基因富集分析,利用String数据库进行蛋白互作网络构建。将NC,hsa-miR-1226-3p的mimic或inhibitor,hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞,利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况,另取转染后48 h样品利用Q-PCR检测靶基因表达情况;将NC,hsa-miR-221-5p的mimic或inhibitor分别转染HepG2细胞,48 h后用Werstern blot检测靶基因蛋白表达情况;将NC+p-GCDH-WT质粒,NC+p-GCDH-MUT质粒,hsa-miR-221-5p mimic+pGCDH-WT质粒,hsa-miR-221-5p mimic+p-GCDH-MUT质粒分别转染HepG2细胞,48 h后利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性;将NC,hsa-miR-221-5p mimic,pEGFP N1-GCDH质粒,hsa-miR-221-5p mimic+pEGFP N1-GCDH质粒分别转染HepG2细胞,利用CCK8检测转染后细胞活力的变化情况,transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果从OncomiR和Oncolnc数据库中分别得到223个(P<0.05)和146个(P<0.05)在肝癌中与生存相关的miRNA,两者交集为131个;结合表达分析和生存分析的结果共鉴定出48个促癌miRNA;miRnet共预测出10 278个靶基因,通过生存和表达分析符合预期的为44个,miRNAmRNA共表达分析后的结果显示27个靶基因符合预期。通过Cytoscape软件构建的miRNA-靶基因网络包含了25个促癌miRNA和27个抑癌基因。富集分析结果显示靶基因集中作用于脂肪酸代谢通路。验证实验显示,转染hsa-miR-1226-3p的mimic和inhibitor,hsa-miR-221-5p的mimic和inhibitor后,其对应的靶基因mRNA或蛋白水平均显著改变(P<0.05);hsa-miR-221-5p mimic和p-GCDH-WT质粒共转可显著降低其荧光素酶的活性(P<0.05);pEGFP N1-GCDH质粒和hsa-miR-221-5p mimic共转可显著恢复其对细胞活力,以及细胞迁移、侵袭能力的影响(P<0.05)。结论通过综合分析鉴定了肝癌中的促癌miRNA并构建了其调控网络;脂肪酸代谢可能是肝细胞癌中促癌miRNA发挥作用的重要的靶标信号通路之一。hsa-miR-221-5p/GCDH轴是肝癌进展的重要分子机制。

LncRNA SNHG9敲除对胶质瘤细胞增殖影响及其作用机制的生物信息学探讨

目的利用CRISPR-Cas9结合流式单细胞分选构建lncRNA SNHG9基因敲除的U251细胞株,检测基因敲除对细胞增殖能力的影响。利用生物信息学分析探讨SNHG9基因发挥功能的可能机制。方法在SNHG9基因上、下游分别设计一个Cas9作用靶点,将两对单链向导RNA的引物模板退火连接px330-EGFP载体,构建成功的目的质粒共转染U251细胞后,通过流式单细胞分选在96孔板中培养,通过PCR扩增和测序验证筛选得到SNHG9敲除成功的单克隆细胞株并扩大培养。RTCA方法检测SNHG9敲除后细胞增殖能力的改变。利用在线工具分析lncRNA SNHG9的表达情况,查找共表达基因并进行富集分析。结果构建成功用于SNHG9敲除的质粒。培养共存活了8个克隆,且得到1株SNHG9成功敲除的细胞株。敲除细胞的增殖能力明显降低(P<0.05)。分析显示SNHG9在胶质母细胞瘤(GBM)组织中高表达,富集分析显示共表达基因主要与线粒体的功能相关。结论成功建立了SNHG9敲除的克隆细胞株且能抑制U251细胞的增殖,生物信息学分析显示SNHG9可能参与线粒体的功能调控。

病毒性心肌炎血清外泌体来源的miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡

目的探讨病毒性心肌炎血清外泌体miR-320对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法使用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射,建立病毒性心肌炎小鼠模型;采用血清外泌体抽提试剂盒提取血清外泌体,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞摄取外泌体情况;使用miR-320抑制剂或模拟物转染心肌细胞,实时荧光定量PCR检测miR-320表达水平;采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(BAX)表达水平;生物信息学预测miR-320靶基因并进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析;荧光素酶报告基因检测miR-320与其靶基因磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1(Pik3r1)的作用关系;Western blot法检测miR-320对蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路蛋白的影响。结果病毒性心肌炎血清外泌体促进心肌细胞凋亡并上调BAX水平,同时降低Bcl2水平;病毒性心肌炎小鼠心肌组织中miR-320显著上调,且miR-320成熟体和miR-320前体pri-miR-320表达在心肌细胞均明显上调;病毒性心肌炎血清外泌体处理的心肌细胞中miR-320水平显著上调,而转染miR-320抑制剂逆转了外泌体引起的miR-320上调及凋亡率升高;Pik3r1是miR-320的靶基因,其过表达逆转miR-320上调导致的心肌细胞凋亡;miR-320过表达抑制AKT/mTOR通路激活。结论病毒性心肌炎血清外泌体miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡。

溶酶体膜蛋白sidt2介导肝脏细胞的凋亡:不通过抑制自噬溶酶体途径

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察Sidt2对肝脏细胞增殖活性和凋亡的影响,并且使用0、10、25、50、100、200μmol/L的氯喹(CQ)摸索肝脏细胞CQ饱和浓度,检测对其自噬流的影响,以及使用CQ进一步探索影响肝脏细胞的增殖活性其凋亡水平的机制。结果成功构建HL7702细胞Sidt2+/+组及Sidt2-/-组。Sidt2基因缺失可导致肝脏细胞增殖被抑制和凋亡水平的增加,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62在蛋白水平上的表达均增加且自噬体含量增加(P<0.05)。结果显示50μmol/LCQ作用下肝脏细胞自噬达到饱和状态,50μmol/L CQ使Sidt2基因缺失时LC3B和P62的表达均增加(P<0.05),且CQ进一步降低肝脏细胞活性,并促进其凋亡水平(P<0.05)。结论在离体水平上,Sidt2基因剔除后,HL7702细胞可表现自噬通路的异常,并且不通过抑制自噬溶酶体途径介导和调控凋亡。

乳酸诱导PLEKHA4的上调参与胶质瘤细胞增殖和凋亡的生物学进程

目的探究乳酸诱导的PLEKHA4基因表达对胶质瘤细胞的生物学功能的影响以及潜在分子机制。方法通过GEO数据库以及GEPIA2在线网站分析PLEKHA4表达水平与胶质瘤病理分级的关系,通过RNA小干扰技术设计PLEKHA4 siRNA后分别转染胶质瘤U251和T98G细胞处理1 d,通过实时细胞分析技术以及Edu实验检测胶质瘤细胞的增殖能力,平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力,流式分析技术检测胶质瘤细胞的周期和凋亡;PCR检测临床收集的胶质瘤样本和对照以及乳酸和葡萄糖治疗下胶质瘤细胞中PLEKHA4的mRNA表达量的变化;体内异种移植小鼠实验检测裸鼠成瘤能力;Westernblot检测cyclinD1、CDK2、Bcl2、β-catenin表达和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化表达水平。结果GEO数据库和在线网站分析结果显示PLEKHA4在胶质瘤组织中高表达且与不良预后相关;RTCA以及Edu实验显示,敲降PLEKHA4抑制胶质瘤细胞的增殖(P<0.05);平板克隆实验显示,敲降组的细胞克隆数目明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术分析结果显示敲低PLEKHA4后细胞周期受到阻滞G1期细胞增加,S期细胞减少,凋亡细胞增加(P<0.01);胶质瘤样本和乳酸和葡萄糖治疗后胶质瘤细胞的PLEKHA4基因的mRNA表达升高(P<0.01);敲降PLEKHA4基因后,裸鼠成瘤能力降低;Westernblot结果显示敲减PLEKHA4后能够抑制cyclinD1、CDK2、Bcl2等功能蛋白的表达,且显著抑制ERK、p38的磷酸化和β-catenin蛋白表达(P<0.01)。结论敲减PLEKHA4基因通过抑制MAPK信号通路的活化和β-Catenin的表达,抑制胶质瘤细胞的增殖促进凋亡,同时糖酵解产生的乳酸诱导PLEKHA4表达上调。

达格列净对射血分数降低的心力衰竭患者的影响

目的 探讨达格列净对射血分数降低的心力衰竭患者(HFrEF)临床症状、生活质量及T淋巴细胞亚群分化的影响。方法 选取2019年2月—2022年2月皖南医学院第二附属医院收治的HFrEF患者60例,按随机数字表法分为对照组(n=30)及观察组(n=30)。对照组予以常规治疗,观察组在对照组基础上予以达格列净治疗,比较两组临床症状改善效果、治疗前后心脏功能指标[左心室舒张期末内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩期末内径(LVESD)]、生化因子水平[胰岛素样生长因子1(IGF-1)、N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)、同型半胱氨酸(Hcy)]、T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))分化情况及生活质量。结果 观察组临床症状改善总有效率较对照组更高(P<0.05);治疗3个月后,与对照组相比,观察组LVEDD、LVESD、NT-proBNP、Hcy及CD8^(+)水平更低(P<0.05),LVEF、IGF-1、CD3^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)水平更高(P<0.05);与对照组相比,观察组身体领域、情绪领域、其他领域评分更低(P<0.05)。结论 达格列净可改善HFrEF患者临床症状及心功能,调节NT-proBNP、Hcy、IGF-1表达水平,促使T淋巴细胞亚群分化平衡,提高患者生活质量。

吡罗克酮乙醇胺盐通过PI3K/AKT通路破坏胶质瘤细胞的线粒体动力学

目的探究吡罗克酮乙醇胺盐(PO)对胶质瘤细胞U251和U373增殖抑制和促凋亡的作用及其机制。方法培养细胞,经不同浓度的PO处理,CCK-8法和EdU实验检测细胞增殖情况;克隆形成实验检测细胞克隆形成;流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1检测线粒体膜电位水平;荧光探针检测线粒体形态学改变,Western blot检测线粒体分裂蛋白DRP1和融合蛋白OPA1;转录组测序和差异基因富集分析后进行Western blot检测验证PI3K,AKT和p-AKT蛋白表达水平。结果CCK-8结果显示,PO可以抑制U251和U373细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性(P<0.001);EdU实验显示,PO处理组的细胞增殖水平明显下降,克隆形成实验的细胞克隆数也明显减少(P<0.01);流式细胞术显示,PO处理组细胞凋亡率增加(P<0.05);荧光探针检测显示,线粒体膜电位水平下降并可致线粒体形态学改变;富集分析显示,下调的基因显著富集于PI3K/AKT通路;Western blot结果显示,PO下调PI3K,AKT和p-AKT蛋白表达水平(P<0.05)。结论PO通过PI3K/AKT通路干扰线粒体融合裂变功能,进而抑制胶质瘤细胞的增殖和增加凋亡。

联合检测LDHA和PD-L1在晚期胃癌PD-1抑制剂疗效预测及预后评估中的价值

背景与目的:胃癌对程序性死亡[蛋白]-1(programmed death-1,PD-1)抑制剂的应答率较低,建立有用的疗效预测方法筛选胃癌PD-1抑制剂治疗优势人群对改善患者预后有重要意义。本研究旨在探讨联合检测乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase,LDHA)和程序性死亡[蛋白]配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)表达对接受PD-1抑制剂治疗胃癌患者的疗效预测和预后评估价值。方法:回顾性分析皖南医学院第一附属医院2020年1月—2022年3月接受PD-1抑制剂治疗的50例晚期胃癌患者的临床病理学资料,采用多因素logistic回归分析影响胃癌PD-1抑制剂疗效的独立危险因素,利用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析联合检测LDHA和PD-L1对胃癌PD-1抑制剂疗效的预测价值,应用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析。结果:LDHA低表达组和高表达组胃癌患者的客观缓解率(objective response rate,ORR)分别为59%和10%,疾病控制率(disease control rate,DCR)分别为83%和29%,差异有统计学意义(P<0.001)。多因素logistic回归分析结果显示,PD-L1阳性联合分数(combined positive score,CPS)<5、LDHA高表达是胃癌PD-1抑制剂疗效不佳的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果提示LDHA联合PD-L1具有较好的胃癌PD-1抑制剂疗效预测价值[曲线下面积(area under curve,AUC)为0.951]。Kaplan-Meier生存分析显示,LDHA低表达合并PD-L1 CPS≥5的胃癌患者在接受PD-1抑制剂治疗后具有更长的总生存期(overall survival,OS,P=0.003)和无进展生存期(progression-free survival,PFS,P<0.001)。结论:LDHA低表达、PD-L1 CPS≥5与胃癌PD-1抑制剂的疗效呈正相关,LDHA低表达合并PD-L1 CPS≥5的胃癌患者接受PD-1抑制剂治疗可显著延长OS和PFS,联合检测LDHA和PD-L1对晚期胃癌患者PD-1抑制剂的疗效预测和预后评估有一定的临床应用价值。

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的:鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法:分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果:成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1~500 nt、1~1000 nt及1~2000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1~2000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1~500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1~2000 nt的序列存在Crp、Pax-6、Elf-1、Gata-1、Hnf-4、BR-C Z4等转录因子结合位点。RT-qPCR结果显示,转录因子中结合分数最高的Crp、Pax-6、Elf-1和Gata-1均在M1型巨噬细胞中低表达,与miR-155的表达方式相反。结论:小鼠miR-155基因TSS上游1~2000 nt均为启动子区域,其中1~500 nt为转录核心区域。转录因子Crp、Pax-6、Elf-1和Gata-1均与miR-155基因启动子区域结合,并负调控miR-155的转录。

哮喘小鼠脾脏来源CD4^+ T细胞促进体外培养巨噬细胞的M2极化

目的探讨哮喘小鼠脾脏来源CD4^+T细胞体外对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化的影响及其机制。方法建立粉尘螨变应原诱导的过敏性哮喘小鼠动物模型。于末次激发24h后,取小鼠肺中叶、HE染色观察炎症改变,运用实时荧光定量PCR检测肺、脾脏组织中miR-155-5p水平;免疫磁珠分选哮喘小鼠脾脏CD4^+T细胞,实时荧光定量PCR检测哮喘小鼠脾脏CD4^+T细胞miR-155-5p水平,同时用流式细胞术检测哮喘小鼠脾脏中CD4^+IFN-γ^+Th1细胞和CD4^+IL-4^+Th2细胞比例的变化;实时荧光定量PCR检测正常组和哮喘组小鼠肺组织中M2相关标志基因精氨酸酶1(Arg1)、类几丁质酶3样分子3(YM1/Chi3l3)、类抵抗素α(retnlα/FIZZ1)的mRNA水平;哮喘小鼠脾脏来源CD4^+T细胞与BMDM进行共培养,实时荧光定量PCR检测BMDM的M2相关标志基因Arg1、YM1、FIZZ1的mRNA水平;通过瞬时转染的方法,将miR-155-5p抑制剂(miR-155-5p-inhibitor)和阴性对照分别转染入哮喘小鼠脾脏CD4^+T细胞后,再与BMDM进行共培养48h后,实时定量PCR测定BMDM中的Arg1、YM1、FIZZ1的mRNA水平。结果与对照组相比,哮喘组小鼠肺、脾脏组织中miR-155-5p水平增加,脾脏CD4^+T细胞miR-155-5p水平升高,且Th2细胞比例上升,肺组织中Arg1、YM1、FIZZ1表达上调;哮喘组小鼠脾脏CD4^+T细胞与BMDM体外共培养后,BMDM的Arg1、YM1、FIZZ1的mRNA水平上调,而转染miR-155-5p-inhibitor后的脾脏CD4^+T细胞并未明显影响体外共培养的BMDM的M2标志基因表达。结论哮喘小鼠脾脏来源的CD4^+T细胞能够促进体外共培养的巨噬细胞向M2极化。

溶酶体膜蛋白Sidt2缺失导致肝脏细胞自噬受损

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62进行共定位,检测自噬小体对P62货物蛋白的识别与封存以及自噬溶酶体的降解。对LC3B及LAMP1进行免疫荧光共定位,检测自噬小体与溶酶体融合过程。使用LysoTracker对酸性溶酶体进行示踪。结果成功构建HL7702细胞Sidt2^(+/+)组及Sidt2^(-/-)组,HL7702细胞Sidt2^(-/-)组较Sidt2^(+/+)组相比,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62表达均增多(P<0.01),免疫荧光结果显示LC3B及P62亦明显增多(P<0.001),同时自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12表达减少(P<0.05)。LC3B与P62共定位降低,LC3B与LAMP1共定位降低,酸性溶酶体数量减少(P<0.05)。结论Sidt2基因的缺失导致人肝脏细胞自噬小体对P62货物蛋白的识别和封存障碍,同时酸性溶酶体数量减少、自噬小体与溶酶体融合障碍导致自噬溶酶体途径受阻,最终导致LC3B与P62发生堆积,肝脏细胞自噬受损。

CircSMARCA5通过miR-4295/PTEN轴调控糖酵解抑制胃癌细胞增殖和侵袭

背景与目的:胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤。作者既往研究发现circSMARCA5在胃癌中表达降低并能够抑制胃癌进展,但其具体机制目前仍不清楚。本研究探究circSMARCA5抑制胃癌细胞增殖和侵袭的分子机制。方法:采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和transwell实验检测过表达circSMARCA5对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。通过检测细胞外酸化率、葡萄糖摄取水平和乳酸生成量,分析过表达circSMARCA5对胃癌细胞糖酵解的影响。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测circSMARCA5、miR-4295和PTEN的基因表达,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测GLUT1和LDHA的蛋白水平。建立BACB/c裸小鼠皮下移植瘤模型,观察过表达circSMARCA5对移植瘤生长的影响,利用免疫组织化学方法检测两组皮下瘤中GLUT1、LDHA的表达水平及Ki-67增殖指数。通过双荧光素酶报告基因实验、Pearson相关性分析和RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验检测circSMARCA5与miR-4295、miR-4295及PTEN的靶向调控关系。结果:过表达circSMARCA5能够抑制胃癌细胞增殖和侵袭。CircSMARCA5过表达组细胞的糖酵解速率、糖酵解能力值、葡萄糖摄取水平和乳酸生成量均低于对照组。此外,过表达circSMARCA5能够抑制裸小鼠皮下移植瘤的生长。进一步研究发现,circSMARCA5可发挥分子海绵作用下调miR-4295表达,而miR-4295通过与PTEN mRNA的3′-UTR结合抑制PTEN表达。在circSMARCA5过表达组细胞中上调miR-4295或下调PTEN表达可部分逆转circSMARCA5对胃癌细胞增殖、侵袭和糖酵解的影响。结论:CircSMARCA5通过竞争性结合miR-4295上调PTEN表达,调控细胞糖酵解,从而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。