咖啡酸合成途径重构及其在大肠杆菌中的异源表达

【目的】通过咖啡酸合成途径重构,在大肠杆菌中实现咖啡酸的从头合成;通过优化合成基因的表达提升咖啡酸的合成效率,为咖啡酸及其衍生物的高效合成奠定基础。【方法】克隆约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniaeu)酪氨酸氨解酶编码基因FjTAL和大肠杆菌(Escherichia coli)4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶/核黄素氧化还原酶复合体编码基因EchpaBC,通过基因共表达重构咖啡酸合成途径,导入常用大肠杆菌中进行表达。通过组成型启动子筛选、对香豆酸生物传感器动态调控和关键基因拷贝数增加相结合的方式,构建一系列工程菌株,并利用HPLC分析这些菌株中对香豆酸和咖啡酸的产生情况。随后比较添加不同氮源和底物对咖啡酸产量的影响。【结果】在大肠杆菌中实现了咖啡酸的从头合成;通过启动子工程大幅提升了咖啡酸的合成效率,以葡萄糖为底物时咖啡酸产量从1.40mg/L提升到96.40mg/L,以酪氨酸为底物时咖啡酸从1.78mg/L提升到123.31mg/L;将驱动EchpaBC表达的组成型启动子替换为对香豆酸生物传感器,咖啡酸产量达到162.73mg/L;额外增加一个EchpaBC的拷贝数促进对香豆酸的转化,咖啡酸产量提高到185.15 mg/L。【结论】本研究采用组成型启动子改造、生物传感器调控和关键基因拷贝数增加相结合的策略,优化了FjTAL和EchpaBC的表达,成功获得了咖啡酸高产工程菌株,为咖啡酸的高效合成奠定了基础。