苦参碱对人肝癌细胞HepG_2的细胞形态影响和相关增殖因素的变化

目的 观察苦参碱作用于HepG2 细胞后 ,光镜和电镜下细胞形态结构改变以及AFP、PCNA和分裂指数的变化。方法 倒置显微镜下观察活细胞形态 ;光镜下观察Wright和苏丹Ⅲ染色的细胞形态和分裂指数 ;扫描和透射电镜观察细胞表面和内部超微结构改变 ;免疫组化和图像分析 ,检测AFP和PCNA。结果 未用药细胞具有肿瘤细胞典型的形态特征 ,细胞的分裂指数为 5 3 .8‰ ,胞浆内未见透明颗粒和空泡 ,苏丹Ⅲ染色为阴性。免疫组化染色AFP和PCNA为阳性。苦参碱处理细胞后 ,细胞数量减少 ,散在生长 ,形态呈多形性 ,细胞浆内充满圆形、透明的颗粒。Wright染色 ,细胞浆呈空泡状 ,细胞核变小 ,核浆比减小 ,核仁变小、数目减少 ,细胞的分裂指数降低。苏丹Ⅲ染色 ,胞浆内有阳性的颗粒。电镜下 ,细胞表面微绒毛变短、变粗 ,甚至消失。核内异染色质增多 ,核仁变小、甚至消失。细胞浆内滑面内质网扩张 ,并有脂肪空泡和自噬小体形成。胞浆局部还出现了较多的板层状排列的粗面内质网。细胞核膜和胞膜均完整。AFP和PCNA量 ,随用药浓度和作用时间的增加而降低。结论 苦参碱对HepG2 细胞的生长增殖有抑制作用 ,使HepG2 细胞的某些恶性增殖表型减弱或消失 ,反应了该细胞的恶性程度和侵袭力均减弱或消失。

STAT5诱骗核苷酸对K562细胞中bcl-x启动子转录激活的调控

背景与目的:信号转导和转录活化因子5(signaltransducersandactivatorsoftranscription5,STAT5)组成性激活在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)细胞恶性转化中起重要作用。本文研究STAT5诱骗核苷酸(decoyoligonucleotides,decoyODNs)对STAT5下游靶基因bcl鄄x转录激活的调控作用。方法:设计并合成decoyODNs、错配核苷酸(M鄄ODNs)和FAM标记decoyODNs。FAM鄄decoyODNs作为对照,在脂质体介导下转染白血病细胞K562,流式细胞仪(FCM)和倒置荧光显微镜检测FAM鄄decoyODNs的摄入情况。构建人bcl鄄x启动子的荧光素酶报告质粒pGL3b鄄bclxP,将其与decoyODNs或M鄄ODNs共转染K562细胞,检测转染后K562细胞中荧光素酶的表达。K562细胞分别转染decoyODNs和M鄄ODNs后,用RT鄄PCR检测bcl鄄xL表达,FCM检测细胞凋亡。结果:FAM鄄decoyODNs在终浓度0.04～4μmol/L范围内的摄入量呈剂量依赖性。24h时FAM鄄decoyODNs4μmol/L处理组转染效率高达99.1%,并在倒置荧光显微镜下也观察到细胞内有绿色荧光物质。decoyODNs处理组荧光素酶活性降低[(181.48±204.46)RLU/μgprotein],与对照组[(675.26±62.91)RLU/μgprotein]相比有显著性差异(P<0.05);而M鄄ODNs处理组细胞荧光素酶的活性[(632.07±98.95)RLU/μgprotein]与对照?

Western blot检测蛋白表达的方法改进及初步应用

目的 探讨Western blotting 增强化学发光法 (ECL )在分析细胞周期调控蛋白表达中的应用。方法 采用K562细胞 ,制备细胞核 ,对电泳、封闭、结合、检测等关键步骤进行了实验条件的摸索和改进 ,并对我室研究苦参碱诱导K562细胞分化机制的细胞周期蛋白的表达进行了分析。结果 3 0 μg核蛋白质即可检测到K562细胞中 ,均有不同程度的CyclinE、Cdk2、CyclinD1、Cdk5表达。结论 Western blotting ECL法特异性强、灵敏度高 ,是分析蛋白质表达较为理想的方法。

cDNA芯片检测STAT5诱骗核苷酸对K562细胞凋亡相关基因的影响

目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提取decoy ODNs处理前后的K562细胞总RNA,逆转录合成Cy3、Cy5标记的cDNA探针,与人14K基因表达谱cDNA芯片(V2.0)杂交,扫描获得数据后,用Genespring软件分析对照组和实验组的差异表达基因,半定量RT- PCR验证cDNA芯片结果。结果：2张cDNA芯片检测重复性良好(R=0.9799)。在13824个标记的基因中,检出413个上调基因,其中包括：TIAF1、GAB1、GYPA、DAPK3、TNFRSF1B、IRF1和PML等在内的18个凋亡相关基因；在检出的332个下调基因中,发现PIM1、CCND2、CCND1、MYC和BCL2L1等在内的11个凋亡相关基因；部分基因经半定量RT-PCR证实与cDNA芯片结果一致。结论：Decoy ODNs抑制STAT5信号通路后可引起K562细胞多种凋亡相关基因的变化,本实验为进一步研究STAT5信号通路所调控的凋亡相关基因提供了依据。

重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响

目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Westernblot检测PKR激活情况。结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P<0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用。结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略。

苦参碱对K562细胞培养液中PGE_2含量的影响

目的 :研究苦参碱诱导 K5 62细胞分化的胞外信号。方法 :运用酶联免疫法 ,动态检测苦参碱作用于 K5 62细胞后 ,培养液中 PGE2 含量的变化。结果 :培养液中 PGE2 含量在苦参碱作用于K5 62细胞 2天后有增高 ,并与苦参碱浓度有关。结论 :在苦参碱诱导 K5 62细胞分化的过程中 ,PGE2 含量的增高可能涉及到 PLA2 的激活 ,并且 PGE2 可能作为胞外信号影响 K5 62细胞的增殖与分化。

肿瘤坏死因子在内毒素所致肝损害中的作用

肿瘤坏死因子是具有广泛生物学活性的多肽介质,能介导内毒素的多种生物学作用及病理生理效应,在内毒素所致的肝损害中起着重要的促炎介质作用。本文综述了肿瘤坏死因子的一般生物学特性以及肿瘤坏死因子在内毒素引起肝损害中的作用及其可能机制。

肾功能损害病人尿对大鼠脑、肾K^+-pNPPase活力影响的探讨

K^+-pNPPase,(钾激活对硝基苯硝酸酶)为钠泵的一部分。肾功能损害病人尿及正常人尿经SephadexG-25脱盐后,加入K^+-pNPPase活力测定体系,发现两组尿对酶活力有明显抑制作用。

酵母双杂交系统在细胞信号转导中的应用

酵母双杂交技术是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与巳知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交技术能较全面地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。

诱骗RNA靶向阻断RNA结合蛋白E2诱导K562细胞向粒系分化

目的应用诱骗RNA（decoy RNA）靶向阻断RNA结合蛋白E2（hnRNP E2）调节CCAAT增强子结合蛋白（C／EBPα）基因异常翻译的作用，诱导白血病细胞株K562细胞向粒系分化，并初步探讨其分子机制。方法将已构建的hnRNP E2 decoy RNA表达质粒经阳离子脂质体的介导转染K562细胞，用G418筛选出稳定表达细胞株，用RT—PCR和Western blot方法检测该细胞株C／EBPα和粒细胞集落刺激因子受体（G—CSFR）的表达，通过瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态，免疫细胞化学法分析细胞粒系分化抗原CD13、CD15的表达。结果筛选到稳定表达细胞株pG细胞，与未转染的K562细胞相比，其C／EBPα mRNA水平无改变，但相对分子质量42×10^3的C／EBPα蛋白（42kD—C／EBPα）水平升高了（49．7±5．5）％（P〈0．05）；G—CSFR mRNA水平升高了（42．1±3．6）％（P〈0．05），其蛋白水平也升高了（37．4±6．2）％（P〈0．05）；细胞形态学方面观察到pG细胞出现中、晚幼粒细胞甚至成熟粒细胞的特征，且免疫细胞化学法检测显示粒系分化抗原CD13、CD15表达增高[阳性细胞百分比分别为（18、7±2．5）％和（15．2±2．6）％]。结论hnRNP E2 decoy RNA能够诱导K562细胞向粒系分化，G—CSF对其分化过程有促进作用，其作用机制可能与decoy RNA靶向阻断hnRNP E2，调节C／EBPα mRNA翻译，恢复42kD—C／EBPα表达，上调42kD-C／EBPα下游分化基因G-CSFR的表达有关。

MTS1基因β启动子转录活性研究

目的 研究MTS1基因 β启动子在急性T淋巴细胞白血病细胞株中的转录激活情况 ,鉴定 β启动子转录活性的功能片段区。方法 用DNA重组方法 ,构建MTS1基因 β启动子 3′端转录起始点相同 ,而 5′端序列不同的 7种pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法 ,将构建的重组质粒分别转染MTS1基因双等位缺失的Jurkat细胞株 ,检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达 ,观察 β启动子在Jurkat细胞中的激活情况及其基础转录活性片段区。 结果 成功构建了MTS1基因 β启动子 7种不同片段的重组质粒 ,它们在Jurkat细胞中均有转录活性 ,其中 0 .38kbSacⅡ SacⅠ酶切片段是MTS1基因 β启动子转录活性的基础片段。 结论 MTS1β启动子可在Jurkat细胞中被激活。