超顺磁性壳聚糖明胶微球作为缓释基因载体的磁转染及释放

背景:利用缓释技术将成血管基因转染至细胞是组织工程骨充分血管化的关键,而选择安全有效的基因载体至关重要。目的:制备超顺磁性壳聚糖纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIOCN)与超顺磁场壳聚糖质粒明胶微球(superparamagnetic chitosan plasmid gelatin microspheres,SPCPGM),并对其进行表征。方法:利用脱水缩合反应制备SPIOCN,对其分子结构、形态和粒径、饱和磁化强度、ζ电位及DNA结合能力进行表征。将SPIOCN溶液与成骨肉瘤细胞MG-63共孵育24 h,采用透射电镜观察细胞吞噬SPIOCN的过程。制备SPCPGM与非磁性壳聚糖明胶微球,将其填入人工多孔骨植入体中,在37℃的PBS(pH=7.4)中进行体外药物溶出实验,采用振荡磁场干预,测定质粒释放量。取成骨肉瘤细胞MG-63及人脐静脉内皮细胞HUVEC-1,分4组转染,PolyMag200(商业化磁转染试剂)/pD NA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pD NA质粒组(对照组),转染24 h后,利用倒置荧光显微镜与流式细胞仪检测转染效果。将人脐静脉内皮细胞HUVEC-1分4组培养,PolyMag200/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA+静磁场组、SPIOCN/pDNA组及裸pD NA质粒组(对照组),培养24,48,72 h后检测细胞存活率。结果与结论:(1)SPIOCN的平均粒径为(187±24) nm,饱和磁化强度为(20.3±4.5) emu/g,ζ电位为(9.5±2.4) mV,具有结合保护质粒DNA转染MG-63细胞及HUVEC-1细胞的能力;(2)SPIOCN贴附细胞膜后,通过胞膜内吞作用进入细胞,细胞浆内可见散布吞噬SPIOCN的内涵体;(3)在磁场干预下,SPCPGM多孔骨植入体的质粒释放量明显高于非磁性壳聚糖明胶微球多孔骨植入体(P <0.05);(4)转染MG-63或HUVEC-1细胞后,PolyMag200/pDNA+静磁场组转染效率高于其余3组(P <0.05),SPIOCN/pDNA+静磁场组高于SPIOCN/pDNA组及对照组(P <0.05);(5)与对照组比较,SPIOCN/pDNA+静磁场组、PolyMag200/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率降低(P <0.05),而SPIOCN/pDNA组细胞存活率无明显变化;SPIOCN/pDNA+静磁场组不同时间点的细胞存活率高于PolyMag200/pDNA+静磁场组(P <0.05);(6)结果表明,SPIOCN具有粒径小、分散性好、毒性低、超顺磁性及结合保护DNA转染细胞的特点,振荡磁场联合SPCPGM是一种较理想的缓释基因载体系统。