肝祖细胞移植对四氯化碳诱导急性肝衰竭小鼠模型肝损伤的修复作用

目的:观察肝祖细胞(HPCs)移植后不同浓度四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝衰竭小鼠模型肝脏修复情况,评价HPCs对肝损伤的修复能力,为评估HPCs移植疗效建立理想的肝衰竭模型。方法:96只ICR小鼠随机分为空白对照组、阴性对照组(0.1%CCl4组、0.5%CCl4组、2.0%CCl4组、10.0%CCl4组)和实验组(0.1%CCl4+HPCs组、0.5%CCl4+HPCs组、2.0%CCl4+HPCs组和10.0%CCl4+HPCs组)。空白对照组小鼠灌胃给予生理盐水,阴性对照组和实验组小鼠灌胃给予不同剂量CCl4。CCl4造模后1d,将实验组和阴性对照组小鼠常规麻醉后切开腹腔,实验组小鼠经脾脏注射HPCs,阴性对照组小鼠注射等剂量无菌生理盐水。动态观察小鼠生命体征,监测其存活率;采血检测小鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性;取肝脏计算肝脏指数;HE染色观察各组小鼠肝脏组织病理学变化;Hoechst33342标记外源性HPCs,激光共聚焦显微镜检测移植HPCs在肝脏中的分布情况及肝脏标志蛋白细胞角蛋白18(CK18)和白蛋白(ALB)的表达。结果:与空白对照组比较,0.1%和0.5%CCl4组小鼠存活率、肝脏指数、AST和ALT活性无明显变化(P>0.05)。病理学检测,肝细胞有自我修复作用,HPCs移植治疗的效果不明显。与2.0%CCl4组比较,2.0%CCl4+HPCs组小鼠AST和ALT活性及肝脏指数降低(P<0.01),存活率增加(P<0.01);病理学检测可见肝细胞再生和大量外源性肝细胞,CK18和ALB表达与内源性肝细胞相当,HPCs移植治疗有效。10.0%CCl4组和10.0%CCl4+HPCs组小鼠2d内全部死亡,无法评估HPCs的治疗效果。结论:HPCs移植可提高急性肝衰竭模型小鼠存活率,改善AST和ALT活性,对肝损伤具有较强的修复能力;且2.0%CCl4诱导的ICR小鼠急性肝衰竭模型能有效反映HPCs移植治疗的效果。

FGF-2真核表达质粒的构建及对C3H10细胞增殖及成软骨分化的影响

目的:构建成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)真核表达质粒,检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响。方法:以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板,PCR扩增目的基因FGF-2,经BglⅡ、SalⅠ双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒,脂质体转染到C3H10细胞中,另设pIRES2-EGFP空载体转染对照组和空白细胞对照组。RT-PCR及Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布,RT-PCR检测成骨及成软骨、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化,Western blot法检测Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达。结果:重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实构建正确;质粒转染C3H10细胞后,其FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较2个对照组明显增高,细胞增殖活力明显增高(P<0.05),软骨相关标志物Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)mRNA转录水平较2个对照组均明显增高(P<0.05),骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA转录水平无明显升高(P>0.05),Wnt5a及Fzd8 mRNA转录水平降低(P<0.05),FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染。结论:成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒,FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力,对C3H10细胞有成软骨效应,但短期成骨效应不明显,可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关。

小鼠心肌祖细胞的永生化及筛选

背景:移植外源干细胞治疗功能性心肌细胞死亡或凋亡,易导致移植并发症,因此心脏本身存在的心肌祖细胞成为理想的种子细胞。目的:建立稳定来源于小鼠心脏的心肌祖细胞株,为研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损时的增殖分化因素提供理想的细胞模型。方法:①分离培养胚胎15.5 d的小鼠心肌细胞。②感染反转录病毒SSR69使心肌细胞永生化,通过抗生素筛选和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌祖细胞。③筛选出具有心肌祖细胞特性的单克隆细胞株。结果与结论:①成功分离培养出心肌细胞,部分细胞可见明显搏动。②感染病毒后,通过潮霉素筛选成功选出76个单克隆,并将其进行命名为CP15-#。③对第1-20号克隆,根据心肌细胞标志基因筛选出具有心肌祖细胞特性的克隆。表明通过可逆SV40 T抗原介导的途径成功建立永生化心肌祖细胞。

质粒FGF-2磁性壳聚糖明胶微球对间充质干细胞增殖分化的影响

本研究目的是探讨超顺磁性壳聚糖FGF-2明胶微球(SPCFGM)对小鼠间充质干细胞增殖分化作用的影响。采用化学共沉淀法制备超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子(SPIOCNs),与质粒FGF-2结合后,用乳化交联法制备SPCFGM和不含质粒FGF-2的超顺磁性壳聚糖明胶微球(SPCGM),激光粒度分析仪和透射电镜检测SPCFGM、SPIOCNs表征,测定SPCFGM的载药量、包封率及体外释放活性,分别用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10细胞培养基中,设SPCFGM组、SPCGM组、空白对照组3组细胞。DAPI染色观察细胞凋亡,Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,CCK8法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布。结果显示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒径分别为(25±9)nm和(140±12)μm。SPCFGM的载药量为57.13%±5.41%,包封率为69.97%±0.04%。3组细胞无凋亡形态,SPCFGM组FGF-2蛋白水平表达较其它两组明显增高,细胞增殖活力明显增高(P<0.05)。SPCFGM可释放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促进C3H10细胞增殖分化,对细胞无毒副作用。

体外诱导微环境对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响及分化后的自发逆转现象

目的体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化,并探讨诱导微环境对其分化的影响及分化后的自发逆转现象。方法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志。采用改良神经元诱导液[Modified neuronal induction media(MNM)]定向诱导MSCs,免疫荧光检测神经细胞表面标志。观察胎牛血清(FBS)浓度、细胞密度、MNM剂量、新鲜与使用过的MNM等不同诱导微环境对MSCs成神经分化的影响。结果 MSCs经MNM诱导后,6h即可见尼氏体,表达神经元特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和微管相关蛋白-2(MAP-2)。随着诱导微环境的改变,MSCs成神经分化率及神经元表面标志表达亦发生改变,且分化后的神经元样细胞可自发逆转。结论 MSCs能够在MNM微环境中定向成神经分化,但诱导微环境的改变可以从量和质两个层面影响MSCs定向分化。

全反式维甲酸通过JNK/Bcl-2信号调控自噬抑制小鼠肝癌细胞恶性生物学行为

目的:探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)通过JNK/Bcl-2信号通路促进细胞自噬,抑制小鼠肝癌细胞恶性生物学行为的作用研究。方法:以小鼠Hepa1-6肝癌细胞为研究对象,共设置5个组:对照组、ATRA组、ATRA+Ad-GFP组、ATRA+Ad-Bcl-2组和ATRA+SP600125组。Western blot及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)检测各组的Bcl-2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)及自噬相关指标的表达,激光共聚焦显微镜观察自噬流,电镜检测细胞内的自噬体数量及形态,划痕实验及Transwell实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力,吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)及过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff, PAS)染色检测细胞的代谢合成能力。结果:相较于对照组,ATRA可增强磷酸化Bcl-2的表达(P<0.05),Bcl-2的过表达抑制自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I和beclin-1的表达(P<0.01),且Bcl-2和beclin-1有蛋白-蛋白的相互结合;JNK的高选择性抑制剂SP600125可降低ATRA诱导的磷酸化JNK和磷酸化Bcl-2的表达,同时抑制自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I和beclin-1的表达,并下调ATRA诱导的自噬水平(P<0.05)。ATRA处理显著减少了迁移和侵袭细胞的数量,增加ICG与PAS染色阳性细胞的数量(P<0.05),而ATRA+Ad-Bcl-2组和ATRA+SP600125组的迁移和侵袭细胞数量显著增加(P<0.05);ICG与PAS染色阳性细胞的数量均显著减少(P<0.05)。结论:ATRA可能通过JNK/Bcl-2信号增强细胞自噬水平,抑制小鼠肝癌细胞的恶性生物学行为。