云芝黄芪有效组分对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:应用云芝黄芪有效组分单方及复方治疗肿瘤小鼠,以此来验证云芝黄芪有效组分单方及复方抗肿瘤的免疫调节活性。方法:建立艾氏腹水癌(EAC)实体型荷瘤小鼠动物模型,随机分为6组,每组10只:生理盐水组(NS,0.1 mL.kg-1.d-1)、阿霉素单纯化疗组(AMD,4 mg.kg-1.d-1,0.2 mL,连续3 d)、云芝糖肽组(PSP,250 mg.kg-1.d-1,0.2 mL)、黄芪多糖组(APS,250 mg.kg-1.d-1,0.2 mL)、云芝黄芪复方组(PSP+APS,250 mg.kg-1.d-1,0.1 mL)和阿霉素云芝黄芪综合治疗组(AMD+PSP+APS,用量同上)。分别治疗30 d后采用免疫细胞化学法检测荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化情况,计算脏器指数、抑瘤率,并与对照组及化疗组进行比较。结果:云芝糖肽组和云芝黄芪复方组小鼠的CD3+,CD4+T细胞百分率以及CD4+/CD8+均显著高于对照组(P<0.05),CD8+T细胞的百分率较阿霉素化疗组显著降低(P<0.05);综合治疗组CD3+,CD4+T细胞百分率显著高于单纯化疗组(P<0.05);单纯化疗组小鼠胸腺指数较对照组明显降低(P<0.05),而综合治疗组的胸腺指数显著高于单纯化疗组(P<0.01);并且各给药组肿瘤质量均显著低于NS对照组(P<0.05)。结论:云芝糖肽、云芝黄芪复方对荷瘤小鼠及经化疗后的荷瘤小鼠均具有免疫增强作用。

云芝糖肽、丹参酮ⅡA对荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节作用

目的:研究云芝、丹参有效组分单体以及复方对EAC荷瘤小鼠的抗肿瘤和免疫调节作用,为肿瘤的中药治疗新方剂的临床广泛应用提供一定的实验基础。方法:建立EAC实体型荷瘤小鼠动物模型,随机分为6组:生理盐水对照组(NS)、阿霉素治疗组(ADM)、云芝糖肽组(PSP)、丹参酮Ⅱ组(TanⅡA)、复方组(PSP+TanⅡA)和综合治疗组(PSP+TanⅡA+ADM),并给予相应药物治疗,应用免疫组化法检测小鼠脾脏IL-2、IL-2R和肿瘤组织中周期蛋白CDK4以及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达,并计算抑瘤率、脏器指数,结果与对照组和化疗组进行比较。结果:云芝糖肽组小鼠脾脏IL-2、IL-2R水平高于NS组和化疗组(P<0.05),各药物治疗组肿瘤Bax均高于化疗组,CDK4均低于NS组(P<0.05),复方组Bax高于NS组(P<0.05),云芝组糖肽、丹参酮ⅡA组、综合治疗组CDK4低于化疗组(P<0.05),云芝糖肽组、复方组与综合治疗组肿瘤Bcl-2低于NS组(P<0.05),各药物治疗组对肿瘤有明显的抑制作用(P<0.05),复方组胸腺指数高于NS组,各药物治疗组胸腺指数均高于化疗组(P<0.05)。结论:云芝糖肽、丹参酮ⅡA对EAC荷瘤小鼠有明显的抗肿瘤和免疫调节作用,并能缓解化疗药物所引起的毒副作用,二者联用存在一定协同作用。

云芝、丹参对EAC荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节的作用

目的研究云芝、丹参有效成分抗肿瘤作用及其免疫调节机制。方法建立EAC荷瘤小鼠,并随机分为6组,连续给药30d后,测定其抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数以及外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。结果运用单因素方差分析进行统计学分析。结果云芝、丹参对肿瘤均有明显的抑制作用(P<0.01);云芝+丹参组胸腺指数高于NS对照组(P<0.05),各用药组胸腺指数明显高于阿霉素对照组(P<0.05);外周淋巴细胞分群:云芝组,云芝+丹参组CD3+、CD4+百分率高于NS对照组(P<0.05);各用药组CD3+、CD4+百分率明显高于阿霉素对照组(P<0.05);除云芝+丹参+阿霉素组外,各用药组CD4+/CD8+比值高于NS组(P<0.05),明显高于阿霉素组(P<0.01)。结论云芝、丹参具有明显的抗肿瘤作用和免疫调节作用,二者联用对免疫调节有一定协同作用,其抗肿瘤机制可能通过提高免疫力来实现。

应用基因芯片技术观察云芝丹参对鼻咽癌患者的免疫调节作用

目的为进一步研究云芝丹参的免疫调节功效,利用基因芯片技术筛选鼻咽癌患者服用云芝丹参后免疫功能指标的变化。方法收集鼻咽癌患者27例,设立中药组和安慰剂组,采用基因芯片技术检测鼻咽癌患者服用中药云芝丹参后免疫功能指标的变化,并与安慰剂组比较分析。结果用基因芯片技术检测中药组鼻咽癌患者服用云芝丹参胶囊后第7天,TNFR2基因表达水平较安慰剂组明显下调(P<0.05)。结论基因芯片技术是筛选肿瘤患者免疫功能指标变化的一种快捷、方便、灵敏的方法。

结核菌H37Ra免疫小鼠后机体抗结核细胞免疫功能的研究

目的探讨小鼠皮内接种H37Ra后,细菌在体内的定植及机体能否产生针对结核菌的免疫力。方法用H37Ra皮内免疫小鼠后15、30、60 d,检测结核菌在小鼠体内脏器的定植;免疫后第30、60天,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的增殖转化刺激指数、ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后IL-2、sIL-2R的表达量。结果小鼠脾、肺脏中有结核菌定植,并至少存活60 d;脾淋巴细胞30、60 d的刺激指数分别为(2.81±0.63)、(2.16±0.52),与BCG皮内接种组无显著性差异,与未免疫组有显著性差异(P<0.05);脾淋巴细胞IL-2、sIL-2R表达量分别为(126.88±8.11)、(91.26±7.29)pg/m l和(138.58±7.67)、(127.09±5.47)pg/m l,与BCG皮内接种组、未免疫组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗结核免疫力,且免疫效果略优于BCG。

云芝丹参的体外促增殖试验及其临床应用研究

目的通过云芝丹参的体外促增殖试验及对乳腺癌患者的临床应用研究，观察其对机体免疫调节活性的影响。方法采用MTT比色法、流式细胞分析法和ELISA法，分别检测云芝丹参对PHA刺激后的健康成人外周血单个核细胞增殖作用及服用云芝丹参胶囊后的乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群和血浆SIL-2R的浓度。结果体外实验，中低浓度的云芝丹参药液（6．25～200μg／mL）对健康成人PBMC有促增殖作用，高浓度（400μg/mL）时则产生抑制作用；而临床试验中，乳腺癌患者血浆sIL-2R浓度、CD8^＋细胞百分率均显著降低，而B淋巴细胞数量及百分率、CD4^＋／CD8^＋比值和Th细胞的百分率都明显升高。结论云芝丹参胶囊对正常人及乳腺癌患者都具有免疫增强作用。

结核菌H37Ra和BCG感染巨噬细胞的实验研究

目的:探讨H37Ra和BCG诱导巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的能力,细菌在巨噬细胞内生存和破坏巨噬细胞的能力。方法:H37Ra和BCG分别感染BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞株及THP-1细胞株,24 h后取培养上清液,Griess法检测NO的释放量;分别于感染后的0、4 d及7 d用1%Triton X-100裂解巨噬细胞后接种罗氏培养基,培养18 d后计数菌落形成单位(CFU);同时于每个时间点,用MTT法检测巨噬细胞存活率的变化。结果:H37Ra和BCG均可诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞株及THP-1细胞株产生多量的NO,两组均显著高于对照组(P<0.05);H37Ra感染组稍高于BCG感染组,但差异无统计学意义(P>0.05);H37Ra和BCG均可在巨噬细胞内生存繁殖,H37Ra或BCG的感染均降低巨噬细胞的存活率,随着感染时间的延长细菌破坏巨噬细胞的效果越来越显著。结论:H37Ra和BCG均可增强巨噬细胞的抗微生物活性,它们对巨噬细胞均具有一定的毒力;H37Ra的毒力低于BCG。

RNA干扰enolase-1基因治疗胃癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰enolase-1基因对人胃癌的治疗作用。方法:根据enolase-1mRNA序列构建表达enolase-1特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)真核表达质粒pMSCVU6/ENO-1si1,pMSCVU6/ENO-1si2,pMSCVU6/ENO-1si3。种植人胃癌SGC-7901细胞于裸鼠皮下建立裸鼠肿瘤模型。将构建成功的三种siRNA质粒分别转染SGC-7901细胞株,pMSCVU6/ENO-1si2和pMSCVU6/ENO-1si3转染裸鼠瘤体内。MTT法检测SGC-7901细胞增殖状况;测量荷瘤裸鼠的肿瘤体积,计算抑瘤率;RT-PCR检测SGC-7901细胞enolase-1mRNA表达;分别以免疫组化SP法和Western blot检测体内外enolase-1蛋白表达。结果:SGC-7901细胞株及裸鼠瘤体均被所采用的质粒成功转染。SGC-7901细胞受pMSCVU6/ENO-1si2转染后,其生长活性受到明显抑制(P<0.01),enolase-1mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01)。体内抑瘤实验表明,pMSCVU6/ENO-1si2组平均瘤体积为(380±26)mm3,pMSCVU6/ENO-1si3组与空白对照组分别为(993±124)mm3和(1102±131)mm3;pMSCVU6/ENO-1si2组抑瘤率为65.52%,pMSCVU6/ENO-1si3组为9.89%;pMSCVU6/ENO-1si2组肿瘤体积明显小于pMSCVU6/ENO-1si3组和空白对照组,差异具有显著性(P<0.01);pMSCVU6/ENO-1si3组和空白对照组之间肿瘤体积无显著差异(P>0.05);pM-SCVU6/ENO-1si2组与pMSCVU6/ENO-1si3组和空白对照组相比,enolase-1蛋白表达减弱。结论:表达siRNA的enolase-1基因特异的真核表达质粒能成功转染体内、外胃癌细胞,其中pMSCVU6/ENO-1si2可有效抑制人胃癌细胞的生长。

Ag85B DNA/H37Ra序贯免疫效果的探讨

目的:初步探讨含结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白的DNA(pTB30m)和结核菌H37Ra序贯免疫小鼠产生的特异性免疫应答。方法:重组质粒pTB30m用碱裂解法制备后进行质量鉴定。用pTB30m肌注初次免疫小鼠2周后,H37Ra皮内加强免疫作为DNA-85B/H37Ra组,同时设定DNA-85B/BCG组、H37Ra组、BCG组及未免疫组。免疫4周或8周后,用ELISA法检测小鼠血清中抗PPD IgG抗体的水平和MTT法检测其脾淋巴细胞的刺激指数(SI)。结果:酶切鉴定pTB30m所含外源基因片段大小正确,并且纯度较高。DNA-85B/H37Ra组小鼠血清中抗PPD IgG水平、脾淋巴细胞的SI均显著高于未免疫组(P<0.05);其抗PPD IgG水平稍高于DNA-85B/BCG组、H37Ra组及BCG组,但它们之间无显著性差异(P>0.05);其脾淋巴细胞的SI显著高于H37Ra、BCG组(P<0.05),而与DNA-85B/BCG组比较,仅在4周有显著性差异。在DNA-85B/H37Ra组内,SI在4周显著高于8周(P<0.05),而血清中抗PPD IgG水平8周均显著高于4周(P<0.05)。结论:DNA-85B/H37Ra序贯免疫策略可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,初步证明其免疫效果略优于BCG。

基因芯片研究云芝糖肽对健康成人外周血单个核细胞Toll样蛋白受体信号转导通路的影响

目的利用基因芯片技术检测PSP对健康成人外周血单个核细胞(PBMC)Toll样蛋白信号转导通路的影响,探索云芝糖肽的免疫调节作用机制。方法体外分离、培养健康成人外周血单个核细胞,摸索云芝糖肽的最佳作用浓度,再分为对照组、云芝糖肽组,72h后收获细胞抽提总RNA,应用Toll样蛋白受体信号转导基因芯片检测PSP对健康成人外周血单个核细胞TLRs信号传导通路中相关基因的变化。结果12.5μg/mL的云芝糖肽可显著促进健康成人PBMC增殖转化(P<0.01);经云芝糖肽作用后上调≥2倍的基因有22个,占18.8%(如γ-干扰素、干扰素-γ-诱导蛋白-10等),下调≥2倍的基因有23项,占19.7%(如Toll作用蛋白、共刺激分子CD86等)。结论云芝糖肽可以调节免疫细胞Toll样蛋白受体转导途径中相关基因的表达,为进一步探讨云芝糖肽的免疫调节作用机理提供了依据。

应用四色荧光标记流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的变化

目的探讨四色荧光标记流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测鼻咽癌患者服用云芝丹参胶囊后外周血淋巴细胞亚群:辅助性T淋巴细胞(CD4+),抑制性和细胞毒T淋巴细胞(CD8+),B淋巴细胞(CD19+),NK(CD16+CD56+)细胞的绝对数和百分率等的变化。方法收集鼻咽癌患者27例,设立中药组和安慰剂对照组,采用四色荧光标记流式细胞术对服用云芝丹参胶囊后的鼻咽癌患者外周抗凝全血的淋巴细胞亚群CD4+细胞、CD8+细胞、B细胞、NK细胞进行绝对计数和相对计数,并对两组结果进行比较分析。结果四色荧光标记流式细胞术结果显示:接受放射治疗的鼻咽癌患者在服用云芝丹参胶囊16周后,外周血T淋巴细胞的绝对数和百分率,以及Ts、Th细胞绝对数的下降均明显低于安慰剂组(P<0.05);中药组和安慰剂组NK细胞百分率的变化均显著增高(P<0.05);但两组NK细胞绝对值的变化不存在明显差异(P>0.05)。结论云芝丹参能明显减轻放射治疗对鼻咽癌患者的淋巴毒性。

基因芯片检测吴茱萸碱对小鼠DC细胞功能调控相关基因表达的影响

目的:利用基因芯片技术检测吴茱萸碱对小鼠骨髓来源DC功能调控相关基因表达的影响。方法:分离BALB/c小鼠骨髓细胞,经GM-CSF体外诱导培养10天的未成熟DC细胞(iDC)经不同因素处理并分为:对照组(Ⅰ)、吴茱萸碱组(EVO)(Ⅱ)、内毒素(LPS)组(Ⅲ)、EVO+LPS组(Ⅳ),24小时后收集各组细胞,抽提总RNA,利用SuperArray公司小鼠DC与抗原提呈细胞基因芯片MM-604对细胞功能相关基因进行检测。结果:Ⅱ/Ⅰ上调≥2倍基因7个,下调≥2倍基因10个;Ⅲ/Ⅰ上调≥2倍基因37个,下调≥2倍基因12个;Ⅳ/Ⅱ上调≥2倍基因46个,下调≥2倍基因7个;Ⅳ/Ⅲ上调≥2倍基因24个,下调≥2基因2个,对这些基因功能进行检索分类,主要涉及细胞因子分泌及其受体表达、抗原摄取、抗原提呈、细胞表面受体、信号传导。结论:吴茱萸碱对DC作用涉及多个基因的表达调控,这些基因控制并影响着DC功能、分化和成熟,为进一步寻找药物靶点提供了线索。