ALEX1在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究ALEX1基因在宫颈癌组织与癌旁组织中的表达情况,探讨ALEX1基因对宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法应用免疫组化检测临床宫颈癌组织与癌旁组织中ALEX1的表达情况,通过小干扰RNA技术沉默ALEX1,并通过流式细胞仪检测沉默ALEX1后He La细胞的周期、凋亡变化情况,利用CCK-8检测其增殖情况及对抗癌药物白藜芦醇敏感性的影响。结果免疫组化结果显示,临床宫颈癌组织中ALEX1高表达。与对照组He La细胞相比,沉默ALEX1实验组细胞生长受到明显抑制,并且增强白藜芦醇对其的抑制作用,细胞周期阻滞在S期。结论沉默ALEX1能有效阻滞He La细胞的生长能力及增强白藜芦醇对He La细胞的抑制作用。

基于科研平台的复合型研究生培养模式探讨

培养具有科技创新能力的复合型人才是研究生教育的新目标,是转化医学领域的重要人才储备。从复合型研究生培养的科研平台实例出发,探讨如何将重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心转变为跨大学科的科研平台,以此作为复合型研究生培养的基地。

大肠不耐热肠毒素B亚单位佐剂活性相关蛋白的筛选

目的通过对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位相互作用蛋白的分析,探讨LTB佐剂活性的分子机制。方法纯化的LTB蛋白和生理盐水分别处理RAW 264.7细胞,pulldown实验分离与LTB有相互作用的蛋白分子,质谱鉴定这些相互作用蛋白;免疫荧光和Western blot分析验证与LTB相互作用蛋白在细胞内的相互作用。结果通过质谱鉴定了25种可能与LTB存在相互作用的蛋白分子,并构建了其相互作用网络图,筛选出可能与LTB免疫调节作用相关的蛋白分子;免疫荧光结果显示神经节苷脂能阻断LTB进入RAW 264.7细胞内,LTB在细胞内与GM130存在相互作用,而Vimentin在生理状态下与LTB不存在相互作用;LTB处理RAW 264.7细胞12 h后,β-actin表达上调,Hspd1表达无变化。结论 LTB佐剂活性的发挥是通过与免疫细胞表面GM1结合,引起内吞,并以小泡的形式到达高尔基体,通过高尔基体的加工。最终通过与Jup结合进而作用于TCF/LEF,引起Bcl-2、IL-6、Runx3等基因表达的变化,发挥促进T细胞和B细胞的增殖分化及活化、分泌细胞因子及免疫球蛋白的作用。

鸭MCHR2的基因克隆及蛋白表达鉴定

目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列;利用Western blot检测鸭、犬和猪的大脑海马区及皮质区MCHR2蛋白的表达情况。结果通过RT-PCR获得鸭、犬、猪脑组织中的目的片段;通过Western blot验证了MCHR2蛋白在鸭脑组织中具有高表达。结论将鸭作为构建动物模型的对象,用于MCHR2基因的相关功能研究具有可行性。

pH值调控肿瘤细胞生长转移的机制

实体瘤存在一个显著的特征是肿瘤胞内呈碱性和胞外呈酸性的微环境,这种酸性微环境能促进肿瘤细胞的生长、侵袭转移。调节肿瘤酸性微环境的主要因子是膜离子交换体,这些离子交换体如NHE和VHA不仅是肿瘤酸性微环境的主要调节者,而且能促进肿瘤细胞的生长转移。通过调节肿瘤胞内外pH值变化可以抑制肿瘤细胞生长转移,但pH值的变化对肿瘤细胞生长转移的调控机制尚不清楚。全文对肿瘤细胞转移的发生机制、肿瘤酸性微环境的形成和膜离子交换体对其调节作用以及三者的关系进行阐述。

常见腹泻性消化道传染病口服疫苗的研究进展

常见腹泻性消化道传染病通常由细菌、病毒等病原体引起,一般通过水源和食物经消化道传播,引起暴发性流行,尤其易引起婴幼儿发病和死亡。本文对常见细菌性和病毒性致腹泻消化道传染病口服疫苗的研究进展作一综述。

人轮状病毒vp4全基因原核穿梭表达质粒的构建及鉴定

目的构建人轮状病毒(Rotavirus,RV)vp4全基因原核穿梭表达质粒,经大肠杆菌表达验证后转化入双歧杆菌。方法从pMD19-T simple-vp4质粒中扩增RV vp4全基因,克隆至pBEX载体中,构建重组表达质粒pBEX-vp4,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,电转化法将重组质粒转化入双歧杆菌,提取质粒,进行PCR及双酶切鉴定。结果重组表达质粒pBEX-vp4经酶切、PCR和测序证明构建正确;在大肠杆菌BL21(DE3)中可表达相对分子质量约87 000的重组VP4蛋白,表达量较低,以包涵体形式表达,可与羊抗人轮状病毒多克隆抗体特异性结合;经PCR及双酶切鉴定,重组质粒pBEX-vp4已成功转入双歧杆菌中。结论重组表达质粒pBEX-vp4可在大肠杆菌中表达RV VP4蛋白,并可经电转化法有效地将重组表达质粒转化入双歧杆菌,为下一步在双歧杆菌中进行表达及研制基于双歧杆菌表达系统的RV重组亚单位口服活疫苗奠定了基础。

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立

目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。