EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的:建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法:首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子(PpolⅠ)、ccdB自杀基因和鼠终止子(mTer)的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果:通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒(pHT-EV71),并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)检测可见20~30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株(6.35 lgTCID50/mL)。结论:通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。