一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的使用重叠PCR方法构建构建△Al46Ply突变体，原核可溶性表达△Al46Ply蛋白，并明确其毒力变化情况；分析肺炎链球菌溶血素（pneumolysin，Ply）在不同血清型肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）中的表达情况。方法以SPND39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体pry基因所需引物；利用重叠PCR方法扩增合成△Al46ply突变体。通过溶血实验分析其溶血活性，利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力，并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况。结果突变体基因测序结果显示，Plyl46位密码子GCT3个碱基被缺失，△Al46ply突变体构建成功，并实现了△Al46Ply的可溶性表达，得到纯度〉90％的重组蛋白。△A146Ply蛋白浓度为100000ng／ml亦未表现出溶血活性。△Al46Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性。Western印迹结果显示，△Al46Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应。结论△Al46Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子，可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体。

clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索clpE基因缺失对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺失菌株,通过动物实验观察clpE基因缺失株毒力改变情况,同时用细胞实验比较clpE基因缺失株和野生菌对宿主细胞的粘附和侵袭能力,最后用实时荧光定量PCR分析自溶素(major autolysin A,lytA)、表面黏附素A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)、肺炎球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,pspA)和神经氨酸酶(neuraminidase,nanA)的表达。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间54h,而缺失株半数致死时间为21d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺失菌在对宿主细胞的粘附能力明显低于野生菌株(P<0.05)。实时荧光定量PCR显示clpE缺失株的五个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);【结论】ClpE通过调控肺炎链球菌多种毒力因子表达,而影响其毒力。

假想的脂蛋白连接酶对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索假想脂蛋白连接酶(putative lipoate-protein ligase,LPL)对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)的方法失活lpl基因,通过PCR、测序鉴定缺陷菌株,采用细胞实验比较缺陷菌和野生菌对宿主细胞的粘附能力,并通过动物实验观察lpl基因缺陷后菌株毒力的变化。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株和缺陷株半数致死时间均为12h,两者比较无统计学差异;缺陷菌在对宿主细胞的粘附能力明显高于野生菌株(P<0.01);体外荚膜染色实验表明,野生菌和缺陷菌均有荚膜。【结论】实验结果提示lpl基因对细菌粘附宿主细胞有抑制作用,但不影响其腹腔感染小鼠的能力。