三种不同脊髓机械性损伤对大鼠继发性神经细胞凋亡的影响研究

目的:探讨脊髓挫伤、脊髓横断及持续性占位损伤对大鼠继发性神经细胞凋亡的影响作用。方法:选取健康雄性Wistar大鼠66只,进行编号后采用随机数字表法分为A(18只,脊髓挫伤)、B(18只,脊髓横断)、C(18只,持续性占位)、D(6只、假手术组)、E(6只、对照组)五组,分别观察伤后1、4、7d各组大鼠的神经细胞凋亡指数、脊髓组织中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表达情况。结果:A、B、C三组大鼠在造模后第1天均出现脊髓灰质和白质染色阳性标记,且三组大鼠的灰质、白质神经细胞凋亡指数差异具有统计学意义(P<0.05);在造模后第4、7天三组大鼠的灰质、白质区域脊髓凋亡细胞指数均呈现出增高趋势(P<0.05);在造模后第1、4、7天C组大鼠的脊髓灰质、白质区域凋亡细胞指数显著高于A组、B组,B组显著高于A组且差异均具有统计学意义(P<0.05)。造模后第1、4、7天A、B、C、D、E组五组大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达差异均具有统计学意义(P<0.05),造模后第1、4、7天A、B、C三组大鼠的Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达显著高于D组和E组(P<0.05)。结论:大鼠脊髓损伤后神经细胞继发性凋亡显著,严重程度与损伤类型有关。

褪黑素对胆红素脑病大鼠脑顶叶皮质AQP4的调控及其保护机制研究

目的:研究脑顶叶皮质水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在褪黑素(melatonin,MT)治疗胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE)中的表达变化,以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路在MT对AQP4调控中的作用,以探讨MT对BE的治疗机制。方法:80只出生5~7 d的健康SD乳鼠,根据其处理方式,随机分为以下5组:假手术组、BE模型组、MT干预组、PKC抑制剂(PKC inhibitor,PKCi)干预组和mTOR抑制剂(mTOR inhibitor,mTORi)干预组。采用HE染色和尼氏染色检测各组鼠脑皮质病理改变;采用干-湿重法测定各组脑顶叶皮质含水量;应用免疫荧光染色法检测脑皮质AQP4的表达区域;运用TUNEL染色法检测脑顶叶皮质神经细胞的凋亡变化;使用Western blot法测定各组鼠脑顶叶皮质AQP4、caspase-3、cleaved caspase-3和PKCε的表达量。结果:HE和尼氏染色显示,MT可减轻胆红素所致神经细胞的损伤。干-湿重法结果显示,MT可降低BE乳鼠脑顶叶皮质脑含水量。免疫荧光染色显示,BE组AQP4荧光强度增加,主要表达于大脑顶叶皮质血管壁和星形胶质细胞膜;MT干预可阻止BE所致AQP4表达的增加。TUNEL染色显示,MT可减少BE所致细胞凋亡。Western blot显示,与假手术组相比,BE组脑顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达增加,PKCε表达降低;MT干预可降低BE鼠顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达,增加PKCε表达。PKCi和mTORi均可下调PKCε的表达,阻止MT通过mTOR/PKC信号通路降低AQP4的表达。结论:MT可通过减少BE大鼠脑顶叶皮质中AQP4的表达来缓解脑水肿,并减少caspase-3介导的神经细胞凋亡。MT下调AQP4表达的机制与mTOR/PKC信号通路的激活有关。

乙酰化生物学研究进展

自从可逆性蛋白质乙酰化修饰发现以来,前30年的研究多局限于探索组蛋白乙酰化修饰参与染色质重塑和基因转录的调控,并发现了作用于组蛋白的乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)、去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)及去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACI)。近十年来,随着在细胞核外的细胞成分中发现乙酰化的非组蛋白及其相关的修饰酶,可逆性的乙酰化修饰在多种细胞生命过程中存在调控潜能逐渐得到认识。然而,复杂的生物学过程涉及到的蛋白质乙酰化修饰谱还不明确。由于技术的发展,目前已经可以在全蛋白质组学水平对乙酰化修饰进行鉴定和定量分析。这些研究结果揭示了乙酰化组学的复杂性,提出乙酰化修饰可能与磷酸化修饰一样普遍存在,并在生物学过程的调控中发挥着重要作用。全面的蛋白质乙酰化鉴定是一个有待继续探索的领域,将会提供更全面更有价值的蛋白质乙酰化修饰谱信息。

5-羟色胺对大鼠神经干细胞分化的反馈调控

目的：探讨神经干细胞（NSCs）是否能分泌单胺类神经递质,且其所分泌的神经递质如5-羟色胺（5-HT）能否反馈调控NSCs的分化.方法：高效液相色谱检测分化7d的NSCs培养液与细胞裂解液中单胺类神经递质;应用免疫细胞化学及蛋白印迹,检测5-HT对NSCs分化以及细胞外信号调节激酶（ERK）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）表达的影响.结果：NSCs的培养液中富含肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、5-HT、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）和多巴胺的代谢产物高香草酸（HVA）,以5-HT与5-HIAA最多,且激动钠通道可以促进其分泌;细胞裂解液中的5-HT,是培养液中的20～24.6倍.5-HT能够上调pERK和pCREB的表达并促进NSCs的分化.结论：钠通道能促进NSCs分泌单胺类神经递质,其中的5-HT能够通过放大ERK、CREB信号转导途径,正反馈调节NSCs的进一步分化.

脑红蛋白改善AD双转基因(APPswe/PS1dE9)小鼠认知功能及其机制研究

目的:观察过表达脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)双转基因(APPswe/PS1dE9)小鼠认知功能的影响,并探讨其机制。方法:成功构建过表达Ngb质粒pNgb和对应的空质粒pCDNA3.1,对AD双转基因小鼠进行侧脑室注射,使其过表达Ngb。采用Morris水迷宫评价过表达Ngb对AD小鼠学习记忆能力和空间探索能力的影响;采用免疫组织化学法检测其对β淀粉样蛋白-42(amyloidβ-protein 42,Aβ_(42))生成的影响;半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-9酶活性检测试剂盒检测酶活性变化;Western blot检测海马组织中磷酸化蛋白激酶B p-Akt(ser473)、总Akt、Caspase-3和Caspase-9表达。结果:过表达Ngb提高了AD转基因小鼠的学习记忆和空间探索能力(P<0.05);明显降低了转基因小鼠海马组织中Caspase-3和Caspase-9酶活性及Aβ_(42)生成(P<0.05);Western blot显示过表达Ngb能抑制脑组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达(P<0.05),而且还能促进p-Akt(ser473)表达(P<0.05);应用磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)抑制剂LY294002后,Caspase-3和Caspase-9活性明显提高(P<0.05)。结论:过表达Ngb对AD双转基因(APPswe/PS1dE9)小鼠有明显的神经保护作用,其机制与Ngb减少Aβ_(42)生成及激活PI3K/Akt信号通路进而抑制Caspase依赖的细胞凋亡途径有关。

高三尖杉酯碱对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响及机制研究

目的探究高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对人黑色素瘤A375增殖的影响及可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测HHT对A375细胞增殖的影响;Hoechst 33258染色法观察染色质凝集情况;细胞克隆形成实验检测HHT对A375细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测HHT对A375细胞凋亡和周期影响;Western blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-PARP、CyclinB1和CDK1蛋白的表达情况。结果CCK-8结果显示,随着药物的剂量(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μmol·L^-1)和作用时间(24、48、72 h)增加,HHT对A375细胞的抑制作用逐渐增强;Hoechst 33258染色和FCM结果显示,HHT可使A375细胞染色质呈凋亡形态改变,促进细胞凋亡,将A375的细胞周期阻滞于G2/M期;克隆形成实验显示,HTT可以抑制A375细胞的克隆形成能力;Western blot结果表明HHT可下调CyclinB1、CDK1和Bcl-2蛋白水平,上调Bax,Cleaved-caspase 3和Cleaved-PARP蛋白表达水平。结论HHT使A375细胞阻滞于G2/M期,抑制A375细胞增殖;HHT可激活线粒体凋亡信号通路,诱导黑色素瘤A375细胞凋亡。

灵芝多糖对D-半乳糖诱导衰老小鼠海马神经元的保护作用

目的:研究灵芝多糖(GLPs)对D-半乳糖(D-gal)诱导的衰老小鼠海马神经元的保护作用和调控机制。方法:将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组:对照组(Control)、衰老模型组(D-gal)、衰老+灵芝多糖给药组(D-gal+GLPs)。连续腹腔注射D-gal建立衰老小鼠模型,治疗组小鼠在造模两周后给予腹腔注射GLPs。通过Morris水迷宫实验检测各组小鼠空间学习记忆能力;HE染色、尼氏染色及透射电镜观察评估海马神经元病理改变;试剂盒测定海马总抗氧化能力(T-AOC)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)活性水平;Western Blot检测海马核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap-1)、血红素加氧酶1(HO-1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)和线粒体裂变相关蛋白1(Drp1)的蛋白表达水平。结果:与模型组相比,D-gal+GLPs组小鼠空间学习记忆能力明显增强(P<0.05);海马区神经元固缩、数量减少及异常分布明显改善,尼氏体增加,神经元及线粒体结构损伤明显改善。GLPs处理后可显著提高衰老小鼠海马总抗氧化能力和GSH/GSSG比值。此外,GLPs治疗后Nrf2、HO-1、Mfn2蛋白表达水平明显增加(P<0.05),而Keap-1、Drp1蛋白表达水平较D-gal组小鼠显著降低(P<0.05)。结论:GLPs能够有效缓解D-gal诱导的衰老小鼠海马神经元损伤并提高小鼠的学习记忆能力,其主要通过Nrf2/HO-1通路提高海马抗氧化能力并维持神经元线粒体正常结构功能来发挥神经保护作用。

电针通过调控神经珠蛋白及PI3K/AKT信号通路抑制胆红素脑病诱导的SD乳鼠脑颞叶皮质细胞凋亡

本研究通过电针刺激介导胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE)模型鼠大脑颞叶皮质神经珠蛋白(neuroglobin,NGB)及PI3K/AKT通路、凋亡通路相关蛋白质的表达变化,以明确电针(electroacupuncture,EA)对于胆红素脑病的治疗作用,并探讨神经珠蛋白在该过程中的作用机制。将39只7日龄SD乳鼠分为假手术(Sham)组、BE模型组、电针治疗(BE+EA)组。经小脑延髓池注射胆红素溶液(10μg胆红素/g体重)制备BE模型,假手术组注射等量生理盐水作为对照,BE+EA组选取百会穴与曲池穴以频率2/15 Hz的疏密波,于造模前12 h、造模完成时及造模后12 h进行3次电针干预,每次15 min。使用HE、尼氏(Nissl)染色及透射电镜检测各组鼠脑颞叶皮质的病理变化及神经元超微结构的改变,结果显示电针处理可减轻BE乳鼠脑颞叶皮质神经元的损伤及增加尼氏体的数量,透射电镜则证实电针处理可改善神经元线粒体的水肿程度。应用免疫荧光染色法检测各组鼠脑颞叶皮质NGB的表达部位及其表达的细胞种类,结果显示NGB主要表达于颞叶皮质神经元中。进一步通过免疫印迹法检测各组鼠脑颞叶皮质中NGB蛋白及PI3K/AKT通路、线粒体凋亡信号通路相关蛋白质的表达,结果显示电针处理可增加NGB、PI3K p110α和pAKT Ser473的表达(分别为P<0.05、0.05和0.01),上调凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值(P<0.001),进而抑制切割胱天蛋白酶3的激活(P<0.05)。通过TUNEL染色法检测各组凋亡细胞的数量,结果证实电针处理使凋亡细胞的数量减少(BE模型组186.00±13.86 vs BE+EA组78.67±11.85,P<0.01)。该研究初步证实,电针刺激可促进胆红素脑病鼠脑颞叶皮质中神经珠蛋白的表达,并进一步激活PI3K/AKT通路,而发挥其神经细胞保护功能,抑制凋亡反应的发生,电针可能成为胆红素脑病治疗潜在的方法。

丙戊酸钠对APP/PS1转基因小鼠自主活动及脑形态结构的影响

目的研究丙戊酸钠(valproic acid,VPA)对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠自主活动及脑组织形态结构的影响,探讨VPA对AD的保护作用及可能机制。方法将3月龄APP/PS1双转基因小鼠及同窝野生型小鼠分为VPA处理组和生理盐水对照组,运用VPA[30 mg/(kg.d)]和等量生理盐水腹腔注射4周。旷场实验观察各组小鼠的自主活动能力;尼氏染色、透射电镜观察各组小鼠脑组织的病理改变。结果行为学结果显示:与野生型小鼠相比,AD模型小鼠自主活动明显减少(P<0.05);野生型小鼠VPA处理组与对照组自主活动无明显差异(P>0.05);而AD模型小鼠VPA处理组比对照组的自主活动明显减少(P<0.05)。尼氏染色显示:AD模型小鼠脑内神经元密度显著低于野生型小鼠。AD模型小鼠中,对照组脑内神经细胞明显肿胀,尼氏小体明显减少而致细胞质淡染,神经细胞密度降低(85.2±13.3);而VPA处理组脑内神经元肿胀程度明显减轻,神经元数量显著回升(116.9±16.2,P<0.05),但VPA不影响野生型小鼠脑内的神经元数量及形态(VPA处理组:142.2±24.4 vs生理盐水对照组:136.7±23.1,P>0.05)。电镜结果显示AD模型小鼠对照组脑内神经元细胞核、线粒体及神经毡肿胀明显,突触结构稀松;而AD模型小鼠VPA处理组脑内神经元细胞核、线粒体及神经毡的水肿明显减轻,突触结构清晰。结论 VPA可显著减少APP/PS1双转基因AD模型小鼠的自主行为,显著减轻躁狂症状;VPA可改善APP/PS1双转基因小鼠脑内神经细胞的形态结构,减少肿胀的神经元并抑制神经元数量的减少。

姜黄素对髓母细胞瘤PI3K/Akt信号通路的作用

目的探讨姜黄素对髓母细胞瘤PI3K/Akt信号通路的作用。方法细胞培养至对数生长期后设对照组(Ct组)和姜黄素处理组(Cur组)。Cur组用20、40、60、80、100μmol/L姜黄素处理24、48、72 h。采用MTT法检测姜黄素对髓母细胞瘤Daoy细胞的生长抑制作用。流式细胞术分析Daoy细胞凋亡率;免疫细胞化学染色检测PI3K、p-Akt和Akt在细胞中表达情况;Western blot和RT-PCR分别检测PI3K、p-Akt和Akt蛋白及mRNA的表达水平。结果不同浓度姜黄素作用不同时间后,细胞受到不同程度的抑制,呈时间-剂量依赖关系(P<0.05)。姜黄素作用48 h抑制作用显著,差异有统计学意义(F=131.829,P<0.05),且IC50为35μmol/L,细胞凋亡也最明显(29.7%)。PI3K、Akt和p-Akt蛋白在Ct组中的阳性表达率分别为80.7%、84.8%和87.5%;Cur组阳性表达率均明显下降,分别为25.3%、58.8%和26.7%。两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示Ct组PI3K、Akt和p-Akt蛋白灰度比值分别为(1.141±0.032)、(1.047±0.174)、(1.173±0.013);Cur组PI3K和p-Akt蛋白灰度比值降低,分别为(0.875±0.029)、(0.958±0.150)。两组比较,差异有统计学意义(t=15.530,33.482,P<0.05)。RT-PCR显示Ct组PI3K mRNA灰度比值显著高于Cur组[(1.166±0.031)vs(0.833±0.033),t=12.468,P<0.05]。结论姜黄素可能通过抑制PI3k/Akt信号通路,阻碍髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖、诱导凋亡。

姜黄素对人肺癌A549细胞增殖的影响及机制

目的探讨姜黄素对肺癌A549细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法体外培养肺癌A549细胞,用不同浓度的姜黄素(5、10、20、40μmol/L)处理不同的时间(24、48和72 h)。采用MTT检测姜黄素对细胞增殖活力的影响。然后,采用脂质体法向A549细胞转染质粒pCDNA3.1和pCDNA3.1-ILK,用姜黄素20μmol/L处理细胞,采用MTT法检测细胞增殖活性,荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞中整合素连接激酶(ILK)、β-连环蛋白(β-catenin)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平;Western blot法检测细胞中ILK、β-catenin、VEGF蛋白的表达。结果与空白对照组比较,随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长,A549细胞的增殖率明显受到抑制,存在剂量-时间依赖性(P<0.05);而细胞中的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表达水平都显著降低;而过表达ILK后,细胞的增殖活性显著增高(P<0.05),且细胞中的ILK、β-catenin、VEGF mRNA和蛋白表达水平又显著增高(P<0.05)。结论姜黄素可通过调节ILK的活性进而抑制肺癌细胞的增殖,其可能的机制与姜黄素使Wnt/β-catenin信号通路失活,并降低下游靶基因VEGF的表达有关。

肝脏X受体激动剂TO901317对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响及其机制

目的:肝脏X受体(liver X receptor,LXR)是核受体超家族中的一员,其中LXR-β是脑细胞内胆固醇含量的重要感受器,而LXR-β/类视黄醇X受体(retinoic X receptor,RXR)-α/ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)胆固醇跨膜转运体系与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生、发展密切相关。LXR激动剂TO901317能影响APP/PS1双转基因小鼠脑组织中β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的生成,但其具体机制尚未阐明。本研究旨在观察LXR激动剂TO901317对高胆固醇饲料饲喂的AD小鼠的认知功能的影响,并从胆固醇代谢的角度探讨其可能的机制。方法:选取24只雄性6月龄APP/PS1双转基因AD小鼠,并随机分为4组,即普通饲料(control)组、高胆固醇饮食(cholesterol rich diet,CRD)组、CRD联合LXR激动剂TO901317饲喂组(TO901317组)以及CRD、TO901317联合LXR拮抗剂GSK2033饲喂组(GSK2033组),每组各6只。以CRD为基础饲料混合猪油、蛋黄粉、鱼肝油等加工制成的颗粒饲料,按每天两次饲喂小鼠;药物组在CRD的同时给予药物,TO901317及GSK2033溶解后均稀释至最终浓度0.03%,并按照小鼠体重通过胃管每日灌胃给药,各组总治疗时间为3个月。饲喂3个月后,采用Morris水迷宫实验观察各组小鼠空间探索和记忆能力的变化;酶标仪比色法检测各组小鼠血清中TC、LDL和HDL的含量;ELISA法检测各组AD小鼠脑组织中Aβ_(42)的表达情况;蛋白质印迹法检测各组小鼠脑组织LXR-β、RXR-α、ABCA1和Caveolin-1蛋白质水平的变化。结果:Morris水迷宫实验结果显示:与control组相比,CRD组小鼠穿越平台的次数、距离和时间均显著降低(均P<0.05);相较于CRD组,TO901317组小鼠穿越平台的次数、距离和时间显著增加(均P<0.05);而相较于TO901317组,GSK2033组上述指标均降低(均P<0.05)。酶标比色仪检测结果显示:CRD组小鼠血清中TC和LDL含量较control组显著增加,而HDL却显著减少(均P<0.001);TO901317组中TC和LDL含量较CRD组减少,HDL含量增加(均P<0.001);GSK2033组小鼠血清中TC和LDL含量较TO901317组却显著增加,HDL含量显著减少(均P<0.001)。ELISA结果显示:4组中CRD组小鼠脑内的Aβ_(42)生成量最多;与CRD组比较,TO901317组小鼠脑内的Aβ_(42)量显著减少(P<0.001),4组中含量最低;control组与GSK2033组含量接近。蛋白质印迹法结果显示:CRD组中LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平较control组显著降低,Caveolin-1蛋白质水平却明显升高(均P<0.01)。而经TO901317处理后,AD小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平明显升高,Caveolin-1蛋白质水平降低(均P<0.001);在GSK2033组中,TO901317对AD小鼠的影响被GSK2033部分逆转,相较于TO901317组,小鼠脑内的LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平降低,Caveolin-1蛋白质水平升高(均P<0.05)。结论:CRD导致转基因AD小鼠产生更加严重的空间探索障碍和学习记忆能力障碍,而LXR激动剂TO901317减轻了这一效应。其机制可能为TO901317通过激活LXR-β/RXR-α/ABCA1跨膜转运体系促进胆固醇外排,降低Caveolin-1的表达并改善脂筏的构成,最终降低脑内Aβ_(42)的生成。

松油烯4醇体内外诱导A549细胞自噬及抑制增殖作用

目的研究松油烯4醇体内外抑制人非小细胞肺癌细胞株A549增殖及诱导自噬的作用。方法不同浓度松油烯4醇作用A549细胞后,应用MTT法检测抑制率及IC50;流式细胞仪检测细胞周期、凋亡、细胞内钙离子浓度变化;透射电镜观察作用前后细胞超微结构的变化。A549细胞移植瘤裸鼠药物连续腹腔注射10 d后分别测量各组移植瘤的平均体积和质量,观察药物的体内抑制肿瘤生长作用。用实时荧光定量PCR和Western blot法检测自噬相关基因BECN1和LC3的体内外表达情况。结果 MTT结果显示松油烯4醇作用于A549细胞24 h后,随着药物浓度升高抑制率逐渐升高,呈浓度依赖性(P<0.05),其24 h的IC50为0.067%(体积分数)。FCM检测结果显示,实验组细胞周期被阻滞在S期,实验组细胞总凋亡率均高于对照组(P<0.05),各实验组细胞内钙离子荧光强度均高于对照组(P<0.05)。电镜结果显示经松油烯4醇处理的A549细胞内自噬泡数量明显增加。实验组移植瘤平均瘤体积和平均瘤质量均低于对照组(P<0.05),高、低剂量实验组抑瘤率分别为77.46%和53.33%。实时荧光定量PCR及Western blot结果显示BECN1和LC3蛋白及mRNA表达量上调(P<0.05)。结论松油烯4醇在体内外可诱导人非小细胞肺癌细胞株A549自噬并抑制其增殖。

雌激素缺乏通过ERβ/GSK-3β通路加重痴呆小鼠认知损害的机制初探

目的:研究雌激素缺乏对APP/PS1双转基因小鼠认知功能和病理变化的影响以及对小鼠脑内雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)表达的影响,探讨雌激素缺乏促进阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发生发展的分子机制。方法:将3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠随机分为假手术组(AD-Sham组)和手术组(AD-OVX组),同月龄野生型小鼠为对照组(WT组),每组10只。分别于术后1个月和术后5个月,采用多种方法检测小鼠外周血雌激素水平、行为学、脑组织形态学及相关蛋白的变化。结果:OVX 1个月(F=22.441,P=0.002)和5个月(F=210.959,P=0.000)组AD小鼠体循环雌激素水平显著下调;OVX 1个月组小鼠子宫无明显缩小,而OVX 5个月出现明显萎缩。Morris水迷宫显示,OVX 1个月后,与AD-Sham组相比,AD-OVX组小鼠找到平台的平均潜伏期和路程显著增加(P<0.05),跨越平台的次数明显减小(P<0.05)。随着OVX时间的延长,至OVX 5个月后,AD-OVX组小鼠找到平台的时间和经过的路程更进一步延长(P<0.05),跨越平台的次数也相应下降(P<0.05)。免疫荧光结果显示,与AD-Sham组相比,OVX 1个月组AD-OVX组小鼠仅大脑皮质内老年斑增多(5.667±0.577 vs.3.333±0.577,P=0.023),而OVX 5个月AD-OVX组小鼠大脑皮质(11.667±1.528 vs.6.000±1.000,P=0.001)和海马内(6.333±1.528 vs.3.667±0.577,P=0.013)老年斑均显著增加。Western blot结果显示,与AD-Sham组相比,OVX 1个月(F=65.625,P=0.000)及5个月(F=18.462,P=0.003)组AD-OVX组小鼠脑内ERβ蛋白水平出现进行性下调(P<0.05);相应地,AD小鼠脑内p-GSK-3β水平降低的趋势与ERβ一致,尽管正常小鼠和AD小鼠脑内GSK-3β总蛋白无明显差异。结论:雌激素缺乏可能通过ERβ/GSK-3β通路加速脑内的病理改变,进而加重痴呆小鼠认知功能的障碍。

健康人群肿瘤坏死因子-α基因多态性的分析

了解汉族健康人群中TNF-A基因多态性的分布,研究TNF-α表达与相关疾病之间的联系。采用PCR-限制性长度片段多态分析法检测140名重庆地区汉族健康人群的TNF-A-308,TNF-A-857位点基因多态性,计算其基因型和等位基因频率,结果显示TNF-A-308 G/G、G/A、A/A基因型的频率分别为89%、11%、1%,其等位基因的发生频率以G等位基因最常见(93%),其次为A等位基因(7%)。TNF-A-857 C/C、C/T、T/T基因型的频率分别为68%、36%、8%,其等位基因发生频率以C等位基因最常见(81%),其次为T等位基因(19%)。由结果可以得出重庆地区汉族健康人群TNF-A-308位点存在G/A多态性,TNF-A-857位点存在C/T多态性。

尿素通道蛋白B基因敲除小鼠海马精氨酸酶Ⅰ和NO水平降低

目的探讨尿素通道蛋白B(urea transporter B,UT-B)与海马内精氨酸酶Ⅰ(arginase Ⅰ,Arg Ⅰ)和一氧化氮(nitri oxide,NO)水平的关系。方法免疫组织化学染色和免疫印迹检测Arg Ⅰ在野生型(wild type,WT)和UT-B基因敲除(knockout,KO)小鼠海马的表达,NO检测试剂盒测定两型小鼠海马NO水平。结果与野生型小鼠相比,UT-B基因敲除小鼠海马Arg Ⅰ阳性细胞数量减少,染色弱,Arg Ⅰ和NO水平降低。结论海马内UT-B对Arg Ⅰ水平和NO生成具有调节作用。

尿素通道蛋白B敲除小鼠海马毛细血管的体视学

目的:研究尿素通道蛋白B(UT-B)敲除小鼠海马组织中尿素对海马毛细血管形态结构的影响,探讨UT-B基因敲除小鼠出现抑郁样行为的病理机制.方法:采用糖水偏好实验观察野生型和UT-B基因敲除小鼠的抑郁样行为,尿素检测试剂盒测定2型小鼠海马尿素水平,免疫组织化学和体视学定量检测2型小鼠海马毛细血管总长度、总体积、总表面积、平均直径等形态学指标.结果:糖水偏好实验中,野生型和UT-B基因敲除小鼠的糖水偏爱指数分别为77.22％±3.93％vs6L 20％±4.42％,差异具有统计学意义.野生型和UT-B基因敲除小鼠海马尿素水平,海马毛细血管的总长度、总体积、总表面积、平均直径差异均有统计学意义.结论:UT-B敲除导致小鼠海马尿素堆积,引发小鼠海马毛细血管的形态改变,毛细血管总体积下降造成海马血灌注量不足而引发小鼠的抑郁样行为.

重组耻垢分枝杆菌联合抗痨药物对鼠结核病治疗作用的探讨

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,MS)与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的Balb/c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组MS、INH+PZA和重组MS联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果:重组MS联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(lgCFU/g)比重组MS和INH+PZA治疗组显著降低;重组MS和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组MS组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组MS联合INH+PZA治疗组和重组MS组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组MS和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛。重组MS联合INH+PZA治疗组肺组织病变最轻。结论:GLS/IL-12重组MS对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组MS联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。

高三尖杉酯碱激活ATM/p53通路抑制人肝癌细胞PLC5增殖

目的探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对肝癌细胞PLC5增殖的影响及其可能的机制。方法采用CCK-8以及EdU检测HHT对PLC5细胞增殖的影响;流式细胞术检测HHT对PLC5细胞周期的影响;Western blot检测周期相关蛋白CyclinA、CDK2、p21以及p53、ATM的表达。结果CCK-8结果显示,HHT(0、5、10、20、40、80μg·L^(-1))分别作用PLC5细胞24、48、72 h后,HHT对PLC5细胞的抑制率明显升高,且呈现浓度和时间依赖性;EdU结果显示,经HHT作用后,PLC5细胞增殖能力明显减弱;流式细胞结果显示,HHT可将PLC5细胞阻滞在S期;Western blot结果显示,HHT可上调PLC5细胞中p21、p53以及ATM的蛋白水平,并下调PLC5细胞中CyclinA、CDK2的蛋白水平。结论HHT可诱导PLC5细胞发生DNA损伤,激活DNA损伤修复信号通路,阻滞细胞周期,从而抑制细胞增殖。

CTNND2基因敲除对小鼠学习记忆的影响

目的:探讨连环蛋白δ2(CTNND2)基因敲除对小鼠学习记忆功能的影响及可能机制。方法:聚合酶链式反应(PCR)验证野生型(WT)和CTNND2^(-/-)两组小鼠基因型。Morris水迷宫检测两组小鼠空间学习记忆功能。高尔基染色法检测两组小鼠海马区神经元树突棘密度的变化。Western Blot检测两组小鼠海马突触相关蛋白磷酸化突触素蛋白(P-Syn)、富含谷氨酸/亮氨酸/赖氨酸/丝氨酸蛋白(ELKS)和突触后致密蛋白95(PSD95)的表达水平。结果:与WT小鼠相比,水迷宫实验结果显示CTNND2^(-/-)小鼠逃逸潜伏期明显延长(P<0.05),通过平台的次数显著减少以及停留在目标象限的时间明显缩短(P<0.05),但是游泳速度不变(P>0.05)。高尔基染色结果显示CTNND2^(-/-)小鼠海马区神经元树突棘密度降低(P<0.05)。Western Blot检测结果显示CTNND2^(-/-)小鼠海马区突触相关蛋白p-Syn、ELKS、PSD95表达均下降(P<0.05).结论:CTNND2基因敲除后,可能通过p-Syn、PSD95和ELKS蛋白表达下调阻碍了小鼠海马区神经元树突以及突触发育,诱发其结构和功能障碍,这可能是CTNND2^(-/-)小鼠学习记忆功能损伤的机制之一。