小鼠造血干细胞衰老体内模型构建及相关生物学研究

目的:构建小鼠造血干细胞(Homatopoietic stemcell,HSCs)衰老体内模型,并探讨其生物学特点,为延缓HSCs衰老的研究提供平台。方法:免疫磁性分选法分离、纯化雄性鼠的Sca-1+HSCs,流式细胞术鉴定分选纯度,免疫荧光检测Sca-1表达。将1×104个雄性供体鼠Sca-1+HSCs经尾静脉移植给9Gy60Coγ射线全身辐射的雌性受体鼠。PCR检测移植后受体鼠造血细胞Y染色体性别决定(Sex-determining region of Ychromosome,Sry)基因,混合造血祖细胞集落(CFU-Mix)培养,细胞周期分析和SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色分析HSCs衰老的生物学特点;计数受体鼠脾集落形成单位(CFU-S)、测定脾脏和胸腺指数,检测受体鼠外周血指标(WBC、RBC、PLT、HCT),评价供体鼠Sca-1+HSCs在受体鼠内衰老和造血功能重建情况。结果:免疫磁性分选法得到的Sca-1+HSCs纯度达87.2%以上。雌性受体鼠的造血细胞均能检测出342 bp的Sry基因。供体鼠Sca-1+HSCs连续2次移植后,形成CFU-Mix集落数量和形成集落的细胞数明显减少;HSCs出现G1期阻滞,G0+G1期细胞比例增高,S期比例下降;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率明显增高;脾脏与胸腺指数明显降低;CFU-S形成能力下降;外周血各项指标均有下降。结论:雄性供体Sca-1+HSCs移植能有效重建受体鼠造血功能,连续尾静脉移植2次能初步建立HSCs复制性衰老的体内模型。

间充质干细胞移植后在溃疡性结肠炎大鼠体内的迁移

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenc hymal stem cells,BMSCs)静脉移植后在体内的迁移。方法:SD大鼠分为A组[免疫结合TNBS/ethanol诱导溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)模型]和B组(正常大鼠),均尾静脉注射1ml荧光标记的BMSCs。移植后第3、7、14d各处死5只,取材做恒冷切片,荧光显微镜下观察BMSCs在骨髓、肺、肝、脾以及消化道内分布,测定荧光的积分光密度(Integral optical density,IOD)值。结果:BMSCs移植后多分布于血管丰富器官,7d时肺内荧光IOD值最高,14d时骨髓内IOD值最高,但无统计学意义。14d时,A组结肠的IOD值高于同组其余消化道各段以及B组结肠(P<0.05)。结论:静脉移植的BMSCs早期主要分布在血供丰富的器官中,迁移至受损结肠的BMSCs高于正常结肠。

当归多糖对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

目的研究当归多糖(APS)对电离辐射引起小鼠骨髓损伤的影响,旨在阐明APS对辐射性造血损伤的保护作用。方法采用直线加速器一次性4.0Gy剂量全身均匀照射C57BL/6小鼠,建立小鼠放射损伤动物模型。取外周血并进行常规检测,提取骨髓单个核细胞(BMNC)并计数;骨髓切片染色观察骨髓造血细胞数量改变;流式细胞术检测细胞周期,细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测p53的表达。结果与对照组相比,生理盐水(NS)组外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)及BMNC计数均明显减少,骨髓腔内造血组织显著减少,BMNC G0/G1期比例、凋亡率、p53表达均升高;2mg/kg APS组和8mg/kg APS组均能提高外周血WBC、RBC、PLT及BMNC计数,增加骨髓腔内造血细胞数量,降低G0/G1期细胞比例以及细胞凋亡率。结论 APS可以促进骨髓造血系统恢复,对辐射损伤具有良好的保护作用。

当归多糖对电离辐射致小鼠骨髓单个核细胞凋亡及氧化损伤的影响

目的:探讨当归多糖(Angelica polysaccharides,APS)对电离辐射引起小鼠骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclearcell,BMNC)凋亡及氧化损伤的影响,旨在阐明APS对辐射性造血损伤的保护作用。方法:直线加速器4.0 Gy一次性全身均匀X射线照射C57BL/6小鼠,建立小鼠放射损伤动物模型。照射后连续7 d腹腔注射不同剂量APS或生理盐水(Normal saline,NS),并于照射后第1、3、7天处死小鼠,提取BMNC,流式细胞术检测细胞周期,细胞凋亡率以及免疫细胞化学法检测P53的表达;比色法检测其超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性以及丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)含量。结果:与正常组相比,NS组G0/G1期细胞比例及凋亡率升高;SOD活性明显降低以及MDA含量明显升高;P53有表达。2 mg/kg APS组和8 mg/kg APS组均能降低G0/G1期细胞比例以及细胞凋亡率,降低突变型P53的表达,提高SOD活性,降低MDA含量。结论:APS可抑制辐射引起的细胞凋亡,还具有抗细胞氧化损伤的作用。

当归多糖对急性辐射损伤小鼠骨髓基质细胞及血管内皮生长因子的影响

目的:研究当归多糖(angelica polysaccharides,APS)对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的保护作用。方法:直线加速器一次性全身均匀X射线(4.0 Gy)照射BALB/c小鼠,照射后腹腔注射不同剂量的APS或生理盐水,并于照射后第7、14、21天处死小鼠,取外周血进行常规检查;观察BMSC贴壁情况、细胞80%贴壁时间;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达水平。结果:与正常组相比,辐射第7、14、21天外周血白细胞及血小板计数明显减少;BMSC贴壁细胞数少且折光性差,达80%贴壁时间明显延长;G0/G1期细胞比例及细胞凋亡率升高;VEGF mRNA的表达降低。辐射APS高剂量组和辐射APS低剂量组均能增加外周血各指标计数,BMSC贴壁细胞数增多且折光性变好,达80%贴壁时间缩短,G0/G1期细胞比例及细胞凋亡率均显著降低,VEGF mRNA的表达显著增加。结论:APS可能通过增强VEGF的表达,提高BMSC的增殖能力,减少其凋亡,从而加速机体造血功能的恢复。

当归多糖对辐射损伤小鼠骨髓单个核细胞凋亡的影响

目的探讨当归多糖(Angelica polysaccharides,APS)对辐射损伤小鼠骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cell,BMNC)凋亡的影响,旨在阐明APS对辐射性造血损伤保护作用的分子机制。方法结果结论方法 C57BL/6小鼠随机分为10组,正常组不作任何处理,其余9组经X射线(4.0Gy)照射后分别给予不同剂量APS或生理盐水,并于照射后第1、3、7d处死小鼠,流式细胞术检测BMNC凋亡率、Bcl-2表达率,Western Blot法(WB)检测P53蛋白、Caspase-3蛋白的表达。结果与正常组相比,生理盐水组BMNC凋亡率、P53蛋白、Caspase-3激活片段(12+17KD)的表达升高,Bcl-2及Caspase-3全长片段(35KD)的表达降低。与生理盐水组相比,2mg/kg APS组和8mg/kg APS组均能降低凋亡率,P53蛋白及Caspase-3激活片段的表达,升高Bcl-2和Caspase-3全长片段的表达。结论 APS对辐射引起的细胞凋亡具有一定的保护作用。

构建糖氧剥夺模型大鼠少突胶质细胞体外培养与分离纯化

目的:对原有少突胶质细胞祖细胞培养与分离纯化方法进行改进,以简单、高效获得少突胶质细胞并建立少突胶质细胞糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型。方法:取SD乳鼠脑皮质,采用两种不同的细胞增殖法和两种不同的分离纯化法分四组培养,分别为细胞因子增殖联合摇床震荡分离纯化法组,B104CM增殖联合摇床震荡分离纯化法组,细胞因子增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法组,B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法组。倒置显微镜下观察神经细胞形态学变化并进行细胞计数。A2B5和髓鞘碱性蛋白鉴定少突胶质细胞并分析其纯度。纯化后的少突胶质细胞祖细胞分化培养3 d后分四组培养,正常组正常培养,低氧组分三组,换无糖DMEM培养基,OGD 1、2、3 h。然后采用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞术分析细胞的凋亡率。结果:(1)B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法较其他3种培养方法收获的少突胶质细胞祖细胞数量多(P<0.05)。(2)A2B5和MBP特异性标记,细胞纯度可达到95%。(3)MTT结果显示:OGD 1 h少突胶质细胞的细胞活力即降低(P<0.05),随着缺氧时间延长细胞活力呈降低的趋势更加明显(P<0.05)。(4)流式细胞测细胞凋亡的结果显示:OGD 1 h、2 h、3 h,细胞的凋亡率分别为14.43%±0.20%,21.99%±0.42%和44.71%±0.20%,均高于正常对照组(6.86%±0.05%,P<0.05)。结论:(1)B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化培养法与其他三种方法比较实验操作简单,收获的少突胶质细胞祖细胞数量最多,可用于少突胶质细胞的培养。(2)OGD可致少突胶质细胞损伤,且与OGD持续时间密切相关,实验成功的建立OGD损伤模型。

急性低剂量辐射对小鼠肝脏及骨髓DNA甲基化的影响

目的观察低剂量辐射(LDR)对小鼠肝脏及骨髓单个核细胞(BMNC)DNA甲基化及甲基化转移酶的影响。方法直线加速器一次性全身X射线1.0 Gy均匀照射C57BL/6小鼠,建立辐射损伤模型。并于照射后1、3、7和14 d取眼球血进行外周血细胞计数,处死小鼠提取肝脏及BMNC,高效液相色谱法检测全基因组DNA甲基化的水平,Western blot检测DNA甲基化转移酶1(DNMT1)、DNMT3A及DNMT3B的水平。结果与正常组相比,辐射组白细胞及血小板计数均明显降低(P<0.05),白细胞在1 d时降至最低,而血小板在3 d时降至最低,14 d仍未恢复正常。辐射组肝及BMNC全基因组DNA甲基化水平下降(P<0.05),其后均逐渐恢复正常。与正常组相比,辐射组肝脏及BMNC DNMT1及DNMT3A表达显著升高(P<0.05),14 d时仍未恢复至正常,DNMT3B的表达也显著升高(P<0.05),但在7 d时已恢复至正常。结论低剂量辐射可导致小鼠肝脏及骨髓DNA甲基化水平的降低及DNMTs表达的升高。

去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞的分化

目的观察去上皮羊膜及其浸提液体外诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向上皮细胞的分化,并探讨其机制。方法从胎儿四肢长骨分离BMSCs,扩增后采用流式细胞术分析第3代(P3)细胞表面抗原(CD29、CD34、CD71和HLA-DR)的表达,并用4,6-乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)标记第4代BMSCs(P4-BMSCs)。机械法去除正常胎盘羊膜上皮,制成去上皮羊膜,并制备去上皮羊膜浸提液。将DAPI标记的BMSCs接种于羊膜上,设加或不加表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、类胰岛素1号生长因子(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)、羊膜浸提液诱导组及细胞爬片对照组,体外诱导培养后,采用免疫荧光组织(细胞)化学染色学法检测各组细胞角蛋白(Cytokeratin,CK)、EGF-R和IGF-1-R的表达,并于诱导后第10天计算CK阳性细胞率。结果原代BMSCs呈典型旋涡状生长,P3细胞表达CD29和CD71,不表达CD34和HLA-DR。羊膜组和细胞爬片组BMSCs在加入EGF或IGF-1诱导后,表达EGF-R和IGF-1-R的时间较未加生长因子的对照组提前2～4 d,表达CK的时间提前2～6 d,单用羊膜组或羊膜浸提液组的表达时间差异无统计学意义(P>0.05);诱导第10天,单用羊膜或羊膜浸提液诱导组的CK阳性细胞表达率明显高于细胞爬片对照组(P<0.05);羊膜与EGF、IGF-1联合诱导组高于单用羊膜组(P<0.05);EGF诱导组高于IGF-1诱导组(P<0.05)。结论羊膜及羊膜浸提液、外源性EGF和IGF-1在体外均可诱导BMSCs向上皮细胞分化,羊膜可能主要通过其所含的细胞因子诱导BMSCs向上皮分化。

芒果苷改善高果糖所致自发性高血压大鼠肾间质纤维沉积的可能机制

目的探讨芒果苷(mangiferin,MA)对高果糖引起的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRs)肾间质纤维沉积的影响及其可能的机制。方法 24只SHRs按随机单位组设计分组法分为对照组、果糖组、果糖+低剂量芒果苷(5 mg/kg)组和果糖+高剂量芒果苷(15 mg/kg)组。实验周期为7周,7周末处死大鼠,取血浆、肾脏组织。检测血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)和肾组织甘油三酯含量,Masson染色后半定量评估肾间质纤维沉积的程度,Real-time PCR检测肾组织单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、CD68、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅳ型胶原蛋白α-Ⅳ链[collagen alpha-4(Ⅳ)chain,col4a4]、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,u PA)mRNA的表达,免疫组化检测肾脏u PA、PAI-1蛋白表达水平。结果与对照组比较,果糖组SHRs肾间质胶原纤维沉积率显著增加(P<0.01),而芒果苷(15 mg/kg)明显减轻果糖引起的SHRs肾间质胶原纤维沉积(P<0.05)。各组肾脏甘油三酯含量没有变化;肾组织MCP-1、CD68、α-SMA、col4a4、TGF-βmRNA也没有明显变化,但芒果苷(15 mg/kg)明显逆转果糖引起的u PA/PAI-1 mRNA比值的降低(P<0.05),同时降低高果糖引起PAI-1蛋白表达水平升高。结论芒果苷能改善高果糖所致SHRs肾脏间质纤维沉积,其机制可能与调控肾组织PAI-1、u PA有关。

跑步锻炼延缓APP/PS1双转基因小鼠内侧前额叶皮质树突棘数量的丢失

目的运用无偏体视学方法精确定量研究跑步锻炼对中老年APP/PS1双转基因模型小鼠内侧前额叶皮质树突棘的作用。方法 12月龄的雄性APP/PS1转基因小鼠分为对照组和跑步组,并将同窝生野生型小鼠作为野生组,每组10只,共30只。对跑步组小鼠进行4个月的跑步锻炼;运用Morris水迷宫方法测试3组小鼠的空间学习记忆能力;运用无偏体视学方法精确定量3组小鼠内侧前额叶皮质树突棘的数量。结果在隐藏平台实验中,对照组平均逃避潜伏期明显大于跑步组和野生组(F=15.738,P<0.001),在空间探索实验中,3组小鼠穿台次数、目标象限游泳时间、目标象限游泳距离百分比差异都有统计学意义(P<0.001);对照组内侧前额叶皮质的树突棘总数显著小于跑步组和野生组(P=0.029,P=0.005)。结论跑步锻炼可以延缓APP/PS1双转基因AD模型小鼠内侧前额叶皮质树突棘的丢失。

TRPC3参与糖氧剥夺致培养的少突胶质细胞凋亡

目的:研究瞬时受体电位通道蛋白3(transient receptor potential channel 3,TRPC3)是否参与糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)少突胶质细胞的凋亡。方法:以原代培养的新生SD大鼠少突胶质细胞为对照组,以OGD2h的少突胶质细胞为模型组,将模型组+Pyr3阻断设为处理组。采用蛋白质免疫印迹法检测TRPC3蛋白的表达水平,MTT试剂盒比色法检测各组细胞存活率,Annexin V-FITC试剂盒染色后经流式细胞仪检测细胞凋亡,fluo-3染色后经流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定胞内游离钙的变化。结果:少突胶质细胞A2B5和MBP特异性标记阳性,细胞纯度可达到95%以上;少突胶质细胞OGD2h成功建立OGD模型;OGD组TRPC3蛋白表达增加;OGD组细胞活性为(54.34±6.55)%,凋亡率为(24.24±0.86)%,与对照组有显著差异(P<0.05),Pyr处理组细胞存活率为(72.26±5.41)%,凋亡率为(14.82±0.28)%,与OGD组有显著差异(P<0.05);OGD组胞内游离钙浓度显著升高,而Pyr3阻断以后可以部分抑制其升高。结论:TRPC3表达增加介导胞内游离钙离子水平的升高可能是OGD少突胶质细胞凋亡的重要原因之一。