人参总皂苷诱导红系血细胞增殖的信号转导研究

目的研究人参总皂苷（TSPG）刺激红系血细胞增殖有关的细胞内信号转导途径。方法用集落形成实验检测TSPG刺激红系造血祖细胞（BFU-E、CFU-E）增殖的能力；噻唑蓝法（MTY）检测红细胞生成素（Epo）对脐血细胞增殖的影响；Western blotting法检测TSPG刺激脐血细胞24h后EpoR表达的变化；免疫沉淀法检测TSPG对EpoR介导的蛋白酪氨酸激酶JAK2和信号传导及转录激活因子5（STAT5）的酪氨酸磷酸化的影响。结果1．TSPG10～75mg／L均能提高脐血细胞形成BFU．E、CFU．E的集落产率，以25mg／L提高幅度最明显；2．以MTT法测定得出Epo2×10^3～5×10^4IU／L均能促进脐血细胞的增殖，以5×10^3IU／L促进增殖效果最明显；3．在不同剂量的TSPG刺激下，造血细胞EpoR的表达变化不明显；4．TSPG作用造血细胞24h后，加入Epo继续刺激0、2、5、30min，JAK2和STAT5的酪氨酸磷酸化均增强。结论TSPG在促进造血细胞增殖的过程中，对造血细胞EpoR表达的影响不显著，但可能在EpoR介导的信号转导过程中增强JA如和sT蛆的酪氨酸磷酸化发挥重要作用。

人参总皂苷对K562细胞红细胞生成素受体表达的影响

目的:探讨人参总皂苷(TSPG)对人红白血病细胞株(K562细胞)红细胞生成素受体(EpoR)表达的影响。方法:采用流式细胞仪检测TSPG作用前后的K562细胞膜EpoR阳性率的变化;免疫细胞化学检测TSPG作用前后K562细胞EpoR表达的变化;以免疫印迹法检测TSPG处理前后K562细胞全细胞、细胞膜和细胞质中EpoR含量的变化。结果:K562细胞膜表达EpoR蛋白的阳性率随TSPG剂量的增加而显著下降;免疫细胞化学染色可见对照组K562细胞胞膜着色深,胞质浅淡,核/质比例大;经TSPG 200mg/L作用72h后,K562细胞胞膜着色明显变浅,胞质着色明显加深且丰富,核/质比例明显降低;不同剂量的TSPG作用K562细胞72h后,全细胞总蛋白中的EpoR的表达无明显差异,经200mg/L TSPG诱导后的K562细胞膜中EpoR蛋白表达下降,而TSPG(100、200、300、400mg/L)诱导K562细胞72h后,胞质EpoR蛋白表达增强,且随着剂量的加大更加明显。结论:TSPG能使K562细胞的EpoR位置重塑,为研究TSPG诱导K562细胞向红系细胞分化的作用机制提供了依据。

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1(+)连接,构建PCDNA3.1(+)-LIF真核表达载体。结果经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功。结论成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1(+)-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础。

人参多糖对K562细胞人粒-巨噬细胞集落刺激因子和促红细胞生成素及其受体表达的影响

目的研究人参多糖(GPS)对人红白血病细胞株(K562)表达人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)及其受体的影响。方法采用细胞体外培养技术,RT-PCR检测GPS诱导后K562细胞中GM-CSF、EPOmRNA的表达、免疫细胞化学方法检测K562细胞经GPS作用后GM-CSF、EPO及其受体蛋白表达的变化、Westernblotting检测GPS诱导后K562细胞GM-CSF、EPO受体蛋白的表达。结果经GPS诱导后,RT-PCR检测显示K562细胞GM-CSFmRNA的表达有所增强,但与对照组相比无统计学意义,EPOmRNA的表达有明显的降低;免疫细胞化学方法检测EPO与GM-CSF蛋白的表达明显减弱,EPO与GM-CSF受体蛋白的表达明显增强;Westernblotting检测GM-CSF、EPO受体蛋白的表达增强。结论GPS既能抑制K562细胞分泌GM-CSF、EPO,又能明显促进GM-CSF、EPO受体的合成和分泌。

人参总皂苷对骨髓造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究

目的 探讨骨髓造血细胞的冷冻保存效果及人参总皂苷 (TSPG)降低冷冻损伤的作用。方法 以 5 %二甲基亚砜 (DMSO)为冷冻保护剂 ,采用逐步降温法将骨髓造血细胞在液氮中保存 3～ 5个月 ,复苏后应用台盼蓝拒染法、集落形成试验、CD34+及细胞总数回收率等 ,测定骨髓造血细胞生物学活性的变化 ;将不同剂量的 TSPG与复苏的骨髓造血细胞共培养 ,应用集落形成试验、MTT比色分析法及流式细胞术等方法检测 TSPG对骨髓造血细胞冷冻损伤可恢复性的影响。结果 骨髓造血细胞在低温保存时一部分细胞会失去增殖能力 ,但这种损伤并不与保存时间成正比。细胞复苏后 ,加入合适剂量的 TSPG(2 5 μg/ m L) ,可明显提高冻存骨髓造血细胞的集落产率 ;TSPG在一定浓度范围内 (2 5～ 5 0μg/ m L )能促进冻存骨髓造血细胞的增殖 ;TSPG (2 5μg/ m L )能促进冻存骨髓造血细胞进入细胞增殖周期。结论 TSPG能促进冷冻骨髓造血细胞的复苏、增殖 ,提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢复性 ,对应用冻存骨髓造血细胞进行造血移植有一定意义。

人参总皂苷体外定向诱导CD34^+细胞分化为粒系血细胞的研究

目的研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34+细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影响。方法应用阴性磁性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34+HSC/HPC向粒系祖细胞集落(CFU-GM)增殖与分化的能力;在SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34+HSC/HPC增殖形成CFU-GM的影响以及CD33+细胞比例的变化。结果TSPG(10～50μg/mL)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长因子在液体培养体系中诱导CD34+细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10～70μg/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33+细胞比例,TSPG20μg/mL是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34+细胞定向诱导分化为粒系血细胞。