等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的 :研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系 ,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法 :通过美国国家生物信息中心 (NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5 .0软件设计引物 ,并经NCBI的Blast2 .0软件检验其特异性。结果 :建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP -PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP—PCR)两种技术 ,并应用于 β2 肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究 ,证实该技术的稳定性和优越性。结论 :等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法 。

高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ在胃癌中的表达及其与E-cadherin、Galectin-3的关系

目的:探讨胃癌高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)、E-cadherin、Galectin-3的表达及其与胃癌发生发展的关系。方法:应用免疫组化SP法检测65例胃癌,20例正常胃黏膜组织中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的表达情况。结果:65例胃癌中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的阳性表达率分别为85%(55/65)、40%(26/65)、74%(48/65)。20例胃正常切缘中GMⅡ、E-cadherin、Galectin-3的阳性表达率分别为50%(10/20)、100%(20/20)、40%(8/20)。GMⅡ、Galectin-3在浸润程度深及有淋巴结转移的胃癌组织中表达明显高于浸润程度浅及无淋巴结转移的胃癌组织(P<0.05)。而E-cadherin则在分化程度低,浸润程度深及有淋巴结转移的胃癌组织中表达明显低于分化程度高,浸润程度浅及无淋巴结转移的胃癌组织(P<0.05)。统计学分析GMⅡ与E-cadherin之间呈负相关(P<0.05),与Galectin-3无相关性(P>0.05)。结论:GMⅡ、Galectin-3在胃癌中高表达,且与癌组织的浸润和转移明显相关。同时GMⅡ与E-cadherin呈负相关,提示GMⅡ可能通过下调E-cadherin的表达来促进胃癌的发展。

中国汉族人群NOS3基因启动子区T-786C、A-922G与第7外显子G894T多态性等位基因及其组合分布

目的 研究中国汉族人群的内皮源性一氧化氮合酶基因启动子区 T 786C、A 92 2G与第 7外显子G894T 3个位点的单核苷酸多态性 (SNP)及其等位基因频率、单倍型组合分布特征。方法 利用嵌套式等位基因特异性引物PCR技术检测NOS3T 786C、NOS3G894TSNP以及单一等位基因特异性引物PCR技术检测NOS3A 92 2GSNP ,应用聚类分析其基因多态性特征。结果 获得 50 4例受试者的 3位点的 2 7种SNP基因型组合的自然分布特征。SNP基因型组合前 5种 :NOS3G894T +A 92 2A +T 786T 64例 (1 2 65 % ) ,NOS3G894G +A 92 2A +T 786T 54例(1 0 67% ) ,NOS3G894T +A 92 2G +T 786T 52例 (1 0 2 8% ) ,NOS3G894G +A 92 2G +T 786T 36例 (7 1 1 % ) ,NOS3G894T +A 92 2G +T 786C33例 (6 52 % )。男亚组的SNP的组合分布发生频度的前 3位的顺序与全样本是一致的。结论 本研究首次揭示了NOS3基因的 3位点的SNP基因型组合分布特征 ,为研究其与生理功能和疾病的关系的提供实验基础。

果糖二磷酸钠镁对大鼠心肌梗塞组织中ATP、ADP和AMP的影响

目的：探讨果糖二磷酸钠镁是否能改善细胞内能量代谢物质——ＡＴＰ、ＡＤＰ和ＡＭＰ的含量。方法：实验选用６０只心肌缺血模型大鼠，随机分为果糖二磷酸钠镁大、中、小剂量组、硫酸镁组、二磷酸果糖组及生理盐水对照组。各组动物均行静脉给药，于给药后４小时取心肌组织制为匀浆，采用ＨＰＬＣ法测定心肌组织中ＡＴＰ、ＡＤＰ和ＡＭＰ的含量。结果：果糖二磷酸钠镁大、中、小剂量心肌组织中ＡＴＰ、ＡＤＰ和ＡＭＰ的含量分别为（６１２．８±１０３．２）、（５３８．０±１４１．２）、（３２５．２±１１３．２）ｎｍｏｌ／ｇ，（４０７．６±１１３．４）、（３８９．４±９１．５）、（３０６．１±１３４．６）ｎｍｏｌ／ｇ和（ １６３７．６±２３６．８）、（ １３６６．８±２７９．３）、（ １１８６．１±３４１．１）ｎｍｏｌ／ｇ，与生理盐水组（１１９．０±２２．８）、（１４６．５±３６．８）和（４３６．７±２１４．９）ｎｍｏｌ／ｇ间有显著差异（Ｐ＜０．０１或０．０５）。结论：果糖二磷酸钠镁能提高心肌缺血组织中ＡＴＰ、ＡＤＰ和ＡＭＰ。

内皮源一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性与高血压病相关性研究

目的分析一氧化氮合酶基因NOS3 A-922 G、NOS3 T-786C与NOS3 G894T单核苷酸多态性(SNP)的等位基因频率分布与高血压病的相关性。方法选择无血缘关系的高血压病患者192例(高血压病组)及正常健康人122例(对照组),获取其静脉血白细胞基因组DNA。采用等位基因特异性引物聚合酶链反应技术检测NOS3NOS3 A-922G、NOS3 T-786C与NOS3 G894T 3个位点的基因型。结果高血压病组NOS3 G894T、NOS3A-922G和NOS3 T-786 C各相应的等位基因型分布频率和等位基因单倍型频率与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。两组按男女性别分层研究,男女人群亦未发现NOS3 A-922 G、NOS3 T-786C与NOS3 G894T各个位点单核苷酸多态性与高血压病有相关性。结论我们的研究未能发现人群中NOS3A-922 G、NOS3 T-786C与NOS3 G894T SNP与其高血压病有明确的相关性,且无性别差异。

家兔胸段硬膜外阻滞麻醉的改良方法

家兔胸段硬膜外阻滞麻醉方法报道甚少，且文献报告多采用切开置管法［1,2］。我们采用自制穿刺针，不切开黄韧带和椎板间孔，直入行硬膜外阻滞麻醉，效果满意，兹介绍如下。

三氧化二砷对食管癌细胞侵袭、转移和血管形成的影响

目的 体外实验研究三氧化二砷(As2O3)对食管癌细胞侵袭转移及血管形成的影响及探讨其作用机制。方法 MTT法观察As2O3对ECA109细胞粘附能力的影响;用Boyden Chamber膜侵袭系统观察As2 O3 对ECA109 游走和侵袭以及诱导内皮细胞形成新生血管的影响;免疫细胞化学观察As2O3对ECA109细胞TGF- β1表达的影响。结果:As2O3作用后,ECA109细胞粘贴率降低(P<0.05),游走穿膜细胞数或侵袭穿膜细胞数均明显低于对照组,诱导内皮细胞形成管腔数及长度均低于对照组(P<0.05)。As2O3能降低TGF β1的表达。结论:As2 O3 能有效抑制食管癌侵袭转移及血管形成,其作用机制可能与通过降低TGF β1的表达,抑制食管癌细胞异质粘附、运动能力及血管形成有关。

他汀治疗对冠心病患者血管内皮功能影响及其预后

目的探讨阿伐托他汀对冠心病患者的血浆内皮素(ET)和降钙素基因相关肽(CGRP)的影响。方法将100例冠心病患者随机分为两组各50例,分别用常规治疗及阿伐托他汀加常规联合治疗,采用放免法观察治疗前后患者ET及CGRP含量。结果较常规治疗组相比,联合使用阿伐托他汀治疗后患者ET明显下降,CGRP明显升高。结论阿伐托他汀能显著改善ET、CGRP代谢失衡状况。

^(131)I-2F7抗体在荷小细胞肺癌裸鼠体内分布及其对肿瘤的生长抑制作用

目的观察^(131)I-2F7抗体对荷小细胞肺癌裸鼠模型的肿瘤生长抑制作用,并分析其在裸鼠体内的分布、靶向性和药代动力学。方法用氯胺T法制备^(131)I-2F7抗体,制备荷H128小细胞肺癌BALB/c裸鼠模型,15只荷瘤裸鼠尾静脉注射^(131)I-2F7抗体7．4 MBq,分别在不同时间测量肿瘤组织及各器官的放射性,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。将20只荷瘤裸鼠随机分成4组:①生理盐水对照组,②单纯2F7抗体治疗组,③单纯^(131)I治疗组和④^(131)I-2F7抗体治疗组。尾静脉注射相应试剂后观察24 d,比较肿瘤的体积、质量,计算抑瘤率。结果给药36 h肿瘤组织的放射性最强,为(6．45±0．33)%ID/g,此时肿瘤/血液放射性比值为2．63,肿瘤/肝放射性比值为4．13。给药24 d后,肿瘤体积和质量分别为①组:(3．431±0．667)cm^3,(6．441±1．234)g;②组:(2．964±0．263)cm^3,(5．876±0．620)g;③组:(2．674±0．897)cm^3,(5．689±1．605)g;④组:(0．746±0．153)cm^3,(1．602±0．194)g。^(131)I-2F7抗体治疗组与其他各组间差异有显著性(P＜O．05)。结论^(131)I-2F7抗体能有效抑制裸鼠小细胞肺癌的生长,对小细胞肺癌治疗有潜在的应用前景。

PARP抑制对小鼠结肠癌细胞侵袭能力的影响

【目的】探讨多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制对小鼠结肠癌CT26细胞体外运动侵袭能力的影响及机制。【方法】细胞运动及侵袭试验观察PARP抑制对CT26细胞运动侵袭能力的影响;Western Blot和明胶酶谱法分别检测PARP抑制对CT26细胞基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达和活性的影响。【结果】5-AIQ处理组CT26细胞运动迁移率(70%±7%)和侵袭率(63%±10%)较5-AIQ未处理组(100%±7%、100%±11%)均减弱(P<0.001)。5-AIQ处理组CT26细胞MMP-2、MMP-9表达(64%±12%、72%±12%)较5-AIQ未处理组(分别为100%±11%,100%±21%)明显减弱(P=0.0003、0.0163)。且CT26细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9活性,在5-AIQ处理组[积分吸光度(IA)分别为0.34±0.07,0.40±0.05]与未处理组(0.48±0.10、0.61±0.08)之间同样存在明显差别(P=0.0248、0.0013)。【结论】实验结果提示,PARP抑制剂5-AIQ可降低CT26细胞的运动及侵袭能力,其可能与5-AIQ抑制PARP进而降低CT26细胞肿瘤侵袭转移相关因子MMP-2和MMP-9的表达和活性有关。

淋巴管生成与细胞间粘附分子-1在宫颈癌中表达的临床意义

目的:探讨宫颈癌组织中细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和淋巴管特异性标记物D2-40标记的淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD)表达与临床病理因素的关系。方法:选择2015年3月至2016年4月我院妇产科行手术切除的宫颈癌患者38例作为实验组,同时期年龄匹配行子宫手术的正常宫颈组织和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织标本各30例作为对照。结果:3组病人一般基线资料比较没有明显差异(P>0.05);LVD和ICAM-1在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈和CIN组织中的表达(P<0.01)。宫颈癌中ICAM-1和LVD表达差异与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstentrics,FIGO)分期相关(P<0.05)。I CAM-1阳性表达的26例宫颈癌组织中的LVD值为(15.13±3.22),ICAM-1阴性表达组的12例宫颈癌组织中的LVD值为(9.85±2.48),两者比较差异有统计学意义(t=5.021,P=0.004)。结论:LVD和ICAM-1在宫颈癌中的表达明显高于正常宫颈组织,两者与宫颈癌的淋巴结转移关系紧密。

汉族人群NOS2 C-1173T、G-954C单核苷酸多态性及其等位基因频率与组合分布特征研究

目的分析中国汉族人群诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区C-1173T、G-954C单核苷酸多态性及其等位基因频率与组合分布特征。方法获取选择自然人群个体565人(男314例,女251例)血白细胞基因组DNA,利用嵌套式等位基因特异性引物PCR技术检测NOS2C-1173T、NOS2G-954CSNP。结果NOS2C-1173TSNP基因型分布CC、CT、TT分别为66.73%、26.37%、6.90%,C、T等位基因频率分别为79.88%、20.12%。NOS2G-954CSNP基因型分布GG、GC、CC分别为61.77%、37.88%、0.35%,G、C等位基因频率分别为80.71%、19.29%。研究发现了NOS2基因在2位点的SNP前5种组合基因型分布NOS2C-1173C+G-954G233例(41.24%),NOS2C-1173C+G-954C143例(25.31%),NOS2C-1173T+G-954G89例(15.75%),NOS2C-1173T+G-954C59例(10.44%),NOS2T-1173T+G-954G27例(4.78%)。结论本研究揭示了中国汉族人群NOS2基因的2位点的SNP基因型及其组合分布特征,为研究该基因SNP与其生理功能和疾病的关系提供实验基础。

NOS2 C-1173T、G-954C单核苷酸双重多态性与高血压病的关系

目的研究中国汉族人群诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因启动子区C-1173T、G-954C单核苷酸双重多态性(SNP)及其基因型组合与高血压病的相关性。方法随机选择的高血压病个体192人(男97例,女95例)以及健康汉族个体109例(男61例,女48例)检测血白细胞基因DNA,利用嵌巢式等位基因特异性引物PCR技术检测NOS2C-1173T(C-T)、NOS2G-954CSNP(G-C),并应用聚类分析其基冈多态性特征。结果NOS2C-T与G-CSNP基因型分布:高血压病组CC基因型频率(64.06％)与正常对照组(59.17％)相比无差异(P>0.05),TT基因型频率较正常对照组低(P<0.05,x2=4.804)。在女性高血压病患者T等位基因频率与正常对照组无显著性差异;而在男性高血压病患者T等位基因频率较正常对照组低(P<0.05,x2=5.182)。NOS2C-T与G-C组合基因型分布发现:高血压病组携带TT+GG与TT+GC总频率明显低于正常对照组(P<0.05,x2=4.804),男性高血压病患者尤为明显(P<0.05,x2=4.2876)。结论(1)中国汉族人群NOS2C-1173T多态性与男性患高血压病有相关性;NOS2G-954CSNP多态性与高血压病无关。(2)在高血压病男性病人携带,T-1173T+NOS2G-954G与NOS2T-1173T+NOS2G-954C频率较正常对照组低。

GW112基因siRNA对人胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响

目的构建靶向GW112siRNA逆转录病毒载体并筛选特异高效的RNAi靶点,研究GW112基因沉默后对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响。方法应用逆转录病毒载体psilencer5.1-H1Retro构建针对GW112基因3个不同靶点的RNAi干扰载体-pSiRNA-GW112(pSi405-GW112,pSi1066-GW112,pSi1480-GW112),将脂质体法转染PT67细胞包装的病毒感染SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳定克隆,RT-PCR鉴定病毒整合,Real-timePCR筛选高效抑制靶点,CCK-8法检测对细胞体外增殖的影响。Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果测序结果证实各干扰靶点的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112构建正确。RT-PCR结果显示除亲本细胞外,经各靶点病毒上清感染的细胞均能扩增出510bp的Puro抗性基因片段。Real-TimePCR分析表明与SGC-7901亲本细胞组相比,7901-Si405,7901-Si1066及7901-Si1480组GW112的转录水平分别只有SGC-7901组的(15.50±0.01)%,(32.40±0.01)%与(57.00±0.02)%。而7901-Sc组GW112表达基本无变化。Si405,Si1066与Si1480靶点的抑制率分别为84.5%,67.6%及43.0%。沉默GW112后导致SGC-7901细胞体外增殖能力显著抑制(P<0.05),并伴随PCNA蛋白表达下调。结论构建的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112能显著抑制SGC-7901细胞的体外增殖能力,且这种增殖抑制与下调的PCNA表达有关。

抗CD_(22)抗体与淋巴瘤的治疗

CD22是B淋巴细胞表达的抗原,其在恶性淋巴瘤细胞上也高度表达。LL2是鼠源性抗CD22抗体,通过131I标记LL2用于复发的非霍奇金淋巴瘤的治疗,观察其疗效及毒副作用。Epratuzumab是人源化的LL2抗体,通过对套细胞淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究,其有效率为18%,不产生人抗鼠抗体(HAMA)。Epratuzumab与Rituxan联合治疗提高疗效。临床研究表明抗CD22抗体作为新的免疫导向治疗药物具有很好的前景。

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞浆差异蛋白组学研究

目的:对HPV-16阳性的H8细胞株(宫颈上皮永生化细胞)和Caski细胞株(宫颈癌细胞)胞浆蛋白进行双向电泳和质谱分析,寻找与宫颈癌相关的特异性差异蛋白质。方法:采用双向凝胶电泳(2-dimensronal gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS)以及SWISS-PROT数据库,对H8和Caski细胞胞浆蛋白进行比较,找出差异蛋白质。结果:通过对宫颈永生化细胞和癌细胞胞浆蛋白2-DE图谱比较和质谱分析,初步鉴定出6个差异蛋白,它们分别为STK3、TRAF5、S100PI、KKb、CDK6、TAF2,其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5这5种蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中高表达,STK3蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中表达缺失。结论:初步发现STK3、TRAF5、S100PI、KKb、CDK6、TAF2蛋白质在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞浆中存在差异表达,通过对其功能的了解研究为宫颈癌前病变向癌转变机制的探讨、特异性肿瘤标志物的寻找提供实验依据。

果糖二磷酸钠镁对垂体后叶素所致急性心肌缺血大鼠血流动力学的影响

目的:1,6-二磷酸果糖对急性缺血所引起的功能不全血流动力学指标有明显的改善作用,并可降低已升高的LVDP,提高心脏指数和左室心搏指数,同时不影响心率和平均动脉压变化,但硫酸镁有松驰血管平滑肌及降压作用。果糖二磷酸钠镁为1,5-二磷酸果糖的镁盐,为探讨该产品是否改善心脏缺血时对血流动力学进行试验。方法:选取60只大鼠,随机分为果糖二磷酸钠镁大、中、小剂量组,硝酸甘油组、二磷酸果糖组和生理盐水组,每组10只,共6组。

7例巨大基底细胞癌的临床与组织病理分析

目的探讨巨大基底细胞癌临床与组织病理学特点。方法回顾性分析比较7例巨大基底细胞癌临床与组织病理学资料。结果巨大基底细胞癌临床上病程长、肿瘤转移率高、对发生部位的组织器官毁损严重,组织病理为多亚型改变的组织病理相。结论早期组织病理学检查确诊及手术治疗是减少、减轻对组织、器官毁损的前提,同时也可降低肿瘤的转移率、手术复发率及死亡率。