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重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定
被引量:
4
1
作者
杨可
杨震
+2 位作者
汪德强
雷寒
周建中
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第3期232-235,共4页
目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,...
目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,利用离子交换柱,分子筛(Superdex 75)等进行分离纯化,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物活性。结果:SAK在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达,利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好,纯度达95%,体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论:应用全基因合成经过优化的基因可在大肠杆菌系统中高效上清表达具有较高纤溶活性的SAK。
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关键词
葡激酶
表达纯化
体外活性
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职称材料
重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
被引量:
2
2
作者
陈检
杨可
+7 位作者
郭珍
张阳丽
张绍城
杨伟
赵沙沙
何泉
汪德强
周建中
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1208-1211,共4页
目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒...
目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
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关键词
重组葡激酶
人HC蛋白
融合蛋白
表达纯化
体外活性
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职称材料
RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定
被引量:
3
3
作者
苟冶然
龙小滨
+5 位作者
白磊
何泉
陈检
张绍城
汪德强
周建中
《基础医学与临床》
CSCD
2015年第3期329-335,共7页
目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-...
目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
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关键词
重组葡激酶
人α微球蛋白
RGD
融合蛋白
溶栓活性
抗血小板聚集
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职称材料
题名
重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定
被引量:
4
1
作者
杨可
杨震
汪德强
雷寒
周建中
机构
重庆医科大学
附属第一医院心内科
重庆医科大学感染病性疾病分子生物实验室
出处
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第3期232-235,共4页
基金
重庆市科委资助项目(编号:2009BB5406)
文摘
目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,利用离子交换柱,分子筛(Superdex 75)等进行分离纯化,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物活性。结果:SAK在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达,利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好,纯度达95%,体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论:应用全基因合成经过优化的基因可在大肠杆菌系统中高效上清表达具有较高纤溶活性的SAK。
关键词
葡激酶
表达纯化
体外活性
Keywords
staphylokinase
expression and purification
activity in vitro
分类号
R541.4 [医药卫生—心血管疾病]
下载PDF
职称材料
题名
重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
被引量:
2
2
作者
陈检
杨可
郭珍
张阳丽
张绍城
杨伟
赵沙沙
何泉
汪德强
周建中
机构
重庆医科大学
附属第一医院心内科
重庆医科大学感染病性疾病分子生物实验室
出处
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1208-1211,共4页
基金
重庆市科委面上项目(CSTC
2009BB5406)
+1 种基金
重庆市科委国际合作项目(cstc2012gg-gjhz0025)
重庆市卫生局重点项目(20111025)
文摘
目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
关键词
重组葡激酶
人HC蛋白
融合蛋白
表达纯化
体外活性
Keywords
recombinant staphylokinase
HC protein
fusion protein
expression and purification
in vitro activity
分类号
R541.1 [医药卫生—心血管疾病]
下载PDF
职称材料
题名
RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定
被引量:
3
3
作者
苟冶然
龙小滨
白磊
何泉
陈检
张绍城
汪德强
周建中
机构
重庆医科大学
附属第一医院心内科
重庆医科大学感染病性疾病分子生物实验室
出处
《基础医学与临床》
CSCD
2015年第3期329-335,共7页
基金
重庆市科委国际合作项目(cstc2012gg-gjhz0025)
重庆市卫生局重点项目(20111025)
国家临床重点专科建设项目[财社(2011)170号]
文摘
目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
关键词
重组葡激酶
人α微球蛋白
RGD
融合蛋白
溶栓活性
抗血小板聚集
Keywords
recombinant staphylokinase
human α-microglobulin
RGD
fusion protein
expression and purification
antiplatelet aggregation
分类号
R3411 [医药卫生—基础医学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定
杨可
杨震
汪德强
雷寒
周建中
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012
4
下载PDF
职称材料
2
重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
陈检
杨可
郭珍
张阳丽
张绍城
杨伟
赵沙沙
何泉
汪德强
周建中
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2012
2
下载PDF
职称材料
3
RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定
苟冶然
龙小滨
白磊
何泉
陈检
张绍城
汪德强
周建中
《基础医学与临床》
CSCD
2015
3
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