卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备

目的:建立CA125串联重复序列(CA125R)原核表达系统,表达纯化重组CA125R蛋白并制备其抗血清。方法:全基因合成一段CA125串联重复序列,并将其克隆至pET-32a(+),构建CA125R蛋白原核表达载体pET-CA125R;将构建好的pET-CA125R载体转化至E.coli BL21(DE3),确定最佳可溶性表达条件,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组CA125R蛋白;纯化重组蛋白经Western blot方法验证后,免疫家兔制备抗血清。结果:成功构建CA125串联重复序列原核表达载体,确定了最佳可溶性诱导表达条件(0.5 mmol/LIPTG,15℃诱导6 h);Western blot结果证实纯化的重组蛋白正确,纯度高;制备的抗血清能特异识别重组CA125R蛋白和天然CA125糖蛋白。结论:成功建立了CA125R高效原核表达系统,并制备了高纯度重组CA125R蛋白及其抗血清。

氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT-PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST-PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。结果 RT-PCR扩增出336 bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε,质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致。将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清;ELISA效价1∶16 000以上;Western blot结果显示,该抗血清与原核表达的GST-PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。结论在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础。

shPLCε通过YAP抑制前列腺癌细胞的丝氨酸/甘氨酸代谢和增殖

目的:该研究旨在探讨磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon(phospholipase C epsilon,PLCε)对前列腺癌细胞丝氨酸/甘氨酸代谢及细胞增殖的影响。方法:慢病毒及质粒转染LNCAP、PC3细胞,q-PCR、Western blot分别检测LNCAP、PC3细胞中PLCε、Yes相关蛋白(yes associated protein,YAP)、丝氨酸/甘氨酸生成酶[包括磷酸丝氨酸转氨酶1(phosphoserine aminotransferase1,PSAT1)、磷酸丝氨酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase,PSPH)、丝氨酸羟甲基转移酶2(serine hydroxymethyltransferase2,SHMT2)及增殖相关基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)]的表达情况;克隆形成实验及MTT实验检测细胞的克隆形成率及增殖活性。结果:(1)感染LV-shPLCε可显著下调前列腺癌细胞LNCAP、PC3中的PLCε、YAP、PSAT1、PSPH、SHMT2及增殖相关基因的mRNA及蛋白质水平,同时抑制细胞的克隆形成能力和增殖活性;(2)在shPLCε组细胞中加入过表达YAP质粒后,能明显逆转YAP、PSAT1、PSPH、SHMT2及增殖相关基因的下调,但加入干扰YAP质粒后结果相反。结论:shPLCε可通过下调YAP的表达抑制前列腺癌细胞的丝氨酸/甘氨酸生成,从而抑制细胞的增殖。