重庆地区健康成人RDW、MPV及WBC水平的分析及参考区间的建立

目的分析重庆地区健康成人红细胞分布宽度(RDW)、平均血小板体积(MPV)及白细胞计数(WBC)水平并建立参考区间。方法分析重庆医科大学附属大学城医院2013年1月至2019年2月体检资料,纳入17177例健康成人数据,其中男9125例、女8052例。按年龄分为青年组(n=11734)、中年组(n=3902)及老年组(n=1541)。使用SPSS25.0软件进行统计学分析,采用Kolmogorov-Smirnov检验数据正态性,采用Kruskal-Wallis H、Mann-Whitney U检验比较组间数据。结果各指标数据均为偏态分布。健康成年男性在不同年龄组间RDW、MPV及WBC水平差异均有统计学意义(P<0.001),健康成年女性在不同年龄组间RDW、WBC水平差异均有统计学意义(P<0.001)。青年组不同性别间RDW、MPV水平差异有统计学意义(P=0.030;P<0.001),中年组不同性别间RDW、MPV及WBC水平差异均有统计学意义(P<0.001),老年组不同性别间仅WBC水平差异有统计学意义(P<0.001)。最终建立了各指标的95%参考区间。结论该地区健康成人RDW、MPV、WBC的分布具有性别和年龄差异。初步建立了RDW、MPV、WBC参考区间,为临床诊疗提供了一定依据。

小檗碱抑制HCT116细胞生长与Wnt/β-catenin信号的关系研究

目的研究小檗碱对结肠癌细胞的增殖抑制作用与Wnt/β-catenin信号的关系。方法结晶紫染色法检测小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用,采用流式分析及West-ern blot研究小檗碱诱导HCT116细胞凋亡;Western blot检测β-catenin蛋白表达、RT-PCR法检测β-catenin mRNA表达,确定小檗碱对其表达的影响;采用外源性过表达β-cate-nin研究小檗碱抑制HCT116细胞增殖与β-catenin的关系。结果小檗碱处理组细胞较对照组细胞增殖明显受到抑制,并诱导HCT116细胞凋亡。小檗碱处理组全细胞、胞质及核内β-catenin蛋白水平均明显较对照组低。外源性过表达β-catenin能减弱小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用。小檗碱处理组β-catenin mRNA表达明显受到抑制。结论小檗碱能抑制HCT116细胞增殖并抑制Wnt/β-catenin信号转导,其机制可能与下调β-catenin mRNA表达有关。

粉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖与Wnt/β-catenin信号的关系研究

目的研究粉防己甲素(tetrandrine,Tet)对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及可能的机制。方法采用结晶紫染色和流式细胞分析检测Tet对HCT116细胞增殖的抑制作用;利用流式细胞术分析和Annexin-V EGFP染色检测Tet对HCT116细胞凋亡的影响;利用萤光素酶报告质粒法检测Tet对Wnt/β-catenin信号转导的影响;采用Western blot检测Tet对HCT116细胞内β-catenin蛋白水平的影响。结果与对照组相比,Tet能抑制HCT116细胞增殖,在5μmol·L-1时已明显抑制细胞增殖(P<0.05);流式分析和Annexin-V EGFP免疫荧光染色检测结果均显示,Tet能明显诱导HCT116细胞凋亡;与对照组相比,Tet处理组LEF/TCF4和Myc/Max报告质粒萤光素酶活性降低,并且Tet处理组细胞内β-catenin蛋白水平也明显下降。结论 Tet能抑制HCT116细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与Tet通过降低细胞内β-catenin蛋白水平,抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。

全反式维甲酸增强骨形态蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化作用

目的研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对骨形态蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响及可能机制。方法采用组织化学染色检测各组第5、7天碱性磷酸酶活性变化。Western blot检测各组第9、11天骨桥素蛋白表达水平。茜素红染色检测各组第14、20天钙盐沉积水平。采用Western blot检测各组Smad-1/5/8蛋白磷酸化水平,以及用荧光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号通路的活化程度。结果 ATRA及BMP9均诱导C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶活性升高,但ATRA合并BMP9组碱性磷酸酶活性明显强于单用ATRA或BMP9组;BMP9合并ATRA组骨桥素蛋白表达水平高于BMP9组;BMP9合并ATRA较单用BMP9能明显促进钙盐沉积。BMP9合并ATRA组Samd1/5/8磷酸化水平明显强于单用BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P<0.01)。结论 ATRA能增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用,其机制可能与促进Smads信号转导活性有关。

苦参碱联合抗肿瘤药抑制K562细胞增殖的研究

目的 观察苦参碱 (Ma)及Ma联合长春新碱 (VCR)、阿糖胞苷 (Ara c)、三尖杉酯碱 (HRT)、阿霉素 (ADM)、柔红霉素 (DNR)对K5 62细胞增殖的影响。方法 用MTT比色法测定Ma及Ma联合常用抗肿瘤药物对K5 62细胞的抑制率。结果 Ma( 160～ 40 0 μg/ml)对K5 62细胞有明显抑制作用。Ma ( 80 μg/ml)与VCR、Ara c、HRT、ADM、DNR分别合用时抑制率较单用VCR、Ara c、HRT时的抑制率高 (P <0 . 0 5 ) ,但较单用ADM、DNR时无明显增加抑制作用。结论 Ma对K5 62细胞增殖具有抑制作用 ,呈剂量相关性。Ma能增强VCR、Ara c、HRT对K5

苦参碱对白血病细胞分泌IL-6和TNF-α的影响

目的 探讨苦参碱诱导分化对白血病细胞分泌白细胞介素 6(IL 6) ,肿瘤坏死因子 (TNF α)的影响。方法 采集 19例儿童白血病和 9例对照骨髓单个核细胞 (MMNC) ,对每例标本分别加苦参碱或不加苦参碱进行体外培养。培养72h收集上清液 ,用双抗夹心法ELISA检测IL 6和TNF α。结果 病人及正常MMNC均有自分泌IL 6、TNF α的能力。但对照组自分泌IL 6、TNF α的作用明显比病人组强 (P <0 .0 5 )。加入与不加入苦参碱对比 ,两组MMNC分泌IL 6、TNF α均无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 两组MMNC均有自分泌IL 6、TNF α的能力。苦参碱对白血病以及对照骨髓单个核细胞分泌IL 6,TNF

Notch信号通过MAPK途径参与BMP9诱导的间充质干细胞C2C12成骨分化

目的探讨Notch信号是否通过MAPK通路影响BMP9诱导C2C12细胞成骨分化。方法利用BMP9腺病毒处理C2C12细胞5d后,用PCR和Western blot检测MAPK通路中P38、Erk1/2和JNK总蛋白以及磷酸化水平。用Notch信号特异性抑制剂DAPT阻断Notch信号后,细胞化学染色分析ALP和钙盐沉积,以及早晚期成骨指标Runx2和OCN在RNA以及蛋白水平上的变化。同时检测BMPs靶基因Id1、Id2和Id3 RNA水平的表达和MAPK信号中P38、Erk1/2和JNK总蛋白以及磷酸化水平变化。结果 BMP9能上调Hey1和Notch信号的配、受体表达;BMP9不影响P38、Erk1/2和JNK总蛋白的表达,但能上调其磷酸化水平;DAPT能抑制BMP9诱导C2C12细胞的ALP活性以及钙盐沉积;影响Runx2和OCN成骨标志物的表达;阻断Notch信号后Id1、Id2和Id3表达受到抑制,P38、Erk1/2磷酸化水平下调,而JNK磷酸化水平无明显变化。结论 Notch信号通过MAPK途径参与了BMP9诱导的C2C12细胞的成骨分化。

肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达及免疫活性分析

目的评价磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(phosphotrans-ferase system,PTS)SPD0295蛋白作为候选疫苗的免疫活性,分析其在不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)中的表达情况。方法以S.pn中D39血清型基因组DNA为模板扩增spd0295基因序列,IPTG诱导表达含6×His标签的SPD0295重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后获得高纯度的目的蛋白;序列比对分析不同血清型S.pn的spd0295基因保守性;SPD0295蛋白与Alum佐剂混合经腹腔注射免疫Balb/c小鼠制备多抗,ELISA法检测其抗体效价,Western blot技术分析抗体的特异性,同时分析该蛋白在7株常见肺炎链球菌中的表达水平。结果spd0295基因在7株不同血清型S.pn中与D39菌株基因序列一致性大于99%;重组蛋白SPD0295免疫小鼠后获得高滴度、高特异性的多克隆抗体;Western blot技术验证了SPD0295蛋白在7株常见肺炎链球菌株中均有表达;黏附抑制试验表明SPD0295蛋白及其抗血清均可抑制细菌的黏附效应。结论 SPD0295蛋白免疫Balb/c小鼠可获得的多克隆抗体具有良好的免疫活性,且在不同血清型S.pn菌株中均有表达,保守性强,是1个潜在的S.pn候选疫苗蛋白。

喹诺酮信号分子对铜绿假单胞菌毒力的影响

目的探讨喹诺酮信号分子(PQS)对铜绿假单胞菌(PA)毒力的影响。方法选择PAO1作为实验菌,分为PQS组、PQS与抑制剂组、抑制剂组以及正常组。QPCR方法检测Ⅲ型分泌系统(T3SS)的调节基因ExsA和毒力蛋白基因ExoS的转录水平;分光光度计检测绿脓素生成量;作用肺泡上皮细胞A549,用平板计数法比较PAO1粘附和侵袭力;构建小鼠腹膜炎模型,观察PQS对小鼠存活时间的影响。结果 PQS增多和减少不影响PAO1的成长情况。与正常组相比,PQS组的ExsA与其调控表达的ExoS毒力蛋白基因转录水平均显著升高(P<0.01);PQS组PAO1产生的绿脓素也明显升高,抑制组却明显下降(P<0.01);与A549细胞作用时,抑制剂组PAO1的粘附和侵袭力均显著降低;腹膜炎模型小鼠PQS组存活时间也降低明显(P均<0.01)。抑制剂组Exos的转录水平有降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,抑制剂组的ExsA转录水平无明显差异,PQS组PAO1的粘附力和侵袭力没有改变(P均>0.05)。结论在PA感染宿主的整个过程中,PQS能维持粘附和侵袭能力,PQS的浓度与绿脓素的产生有正相关关系,从而最终使宿主的存活时间成负相关。

miRNA-30a／30e腺病毒表达载体的构建

目的构建稳定表达成熟miRNA-30a和miRNA-30e腺病毒表达载体。方法小鼠基因组中分别扩增出带有酶切位点的mmu-miR-30a、mmu-miR-30e目的基因,目的基因连接到穿梭质粒pSES-HUS,带有目的基因的穿梭质粒重组到骨架质粒AdEasy1上,重组质粒转染到Hek-293细胞中包装成腺病毒载体,反复扩增之后获得高滴度的pAd-mmu-miR-30a、pAd-mmu-miR-30e腺病毒。用目的腺病毒分3组(RFP对照组,miR-30a组,miR-30e组)感染小鼠Mefs细胞,用荧光定量PCR方法检测mmu-miR-30a、mmu-miR-30e表达情况。结果分别扩增出带有酶切位点的357 bp mmu-miR-30a,324 bp mmu-miR-30e,并成功连接到pSES-HUS上,进一步与AdEasy1重组,包装得到腺病毒表达载体,通过荧光定量PCR检测,Mefs细胞中mmu-miR-30a升高26.46±7.46倍,mmu-miR-30e升高2.76±0.25倍。结论成功构建了成熟miRNA的腺病毒表达载体。

临床生化室室内质量控制性能评价及全面质量控制策略的建立

目的按照每个项目的质量要求,评估生化实验室室内质量控制性能,为每一个检测项目建立个性化全面质量控制策略。方法依据每个项目总允许误差(TEa)以及2010年2月至2010年7月参加罗氏质量控制和卫生部临床检验中心室间质评实验数据确定实验室的不精密(CV%)和不准确度(bias),计算每个项目操作点,利用标准操作规范图(OPSpecs)设计室内质量控制的方法,评估当前使用室内质量控制规则(13s,N=2,R=1)是否满足质量控制性能要求;最后根据评估结果建立全面质量控制(TQC)策略。结果各操作点在OPSpecs上显示:碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等20个项目对当前采用的质控规则有高的误差检出率(Ped),Ped>90%,假失控率(Pfr)<1%,而总胆红素、直接胆红素及载脂蛋白B只有改变质控规则(13s/22s/R4s,N=2,R=1)才能满足高Ped要求(Ped>90%,Pfr=1%),其TQC策略重点是应用统计质量控制;钠和钙改变质控规则为(12.5s,N=2,R=1)时仅有中等Ped(Ped=50%~90%,Pfr=4%),其全面的质控策略应强调统计质量控制、方法改进、误差的防范相结合;而尿素、肌酐、清蛋白及氯的Ped比较低(Ped<50%),TQC策略的重点就应该放在方法改进和误差防范。结论要达到相同质量控制性能,质量要求不同项目其质量控制策略可能会不一样,为每一项目建立全面质控策略是非常必要的。

不同保存方法对尿液样本生化指标的影响

目的了解临床上不同尿液的保存方法对尿生化指标的影响,探讨留取24h尿的适宜保存方法。方法收集55例肾脏内科病人的24h尿。按照尿常规白细胞数>200/μL以及细菌数>1000/μL为标准分为感染性尿液样本组(20例)和非感染性尿液样本组(35例)。每例样本留取三份,分别置于防腐剂(二甲苯)、常温(18-28℃)、冷藏(2-8℃)三种不同条件下保存。检测两组在三种保存条件下:(1)尿蛋白:总蛋白(UTP)、微量白蛋白(m Alb/Cr)、尿免疫球蛋白G(IgG)、转铁蛋白(TRF)、α1微球蛋白(α1-MG);(2)尿电解质:钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)、钙(Ca)、镁(Mg)、磷(P);(3)尿酸(UA),肌酐(Cr)的含量。比较两组在不同保存条件对尿生化指标的影响。结果两组24h尿液在二甲苯、冷藏、常温三种条件下,尿生化指标测定值均无显著性差异(P>0.05);结论 24h尿液的生化指标的测定不受保存方式的影响。

1848名重庆地区汉族女性晚孕期血浆D-二聚体水平的调查研究

目的调查1 848名重庆地区汉族女性晚孕期血浆D-二聚体水平并建立参考区间。方法收集2015年1月至2017年6月在重庆医科大学附属大学城医院住院的1 848名健康单胎晚孕期汉族女性(孕周大于或等于35周)的检验资料,另选202名年龄匹配的同期体检的健康育龄期非孕汉族女性为对照,根据年龄分为18～<30、30～<35、35～<40、40～45岁共4个年龄段,再按胎次将观察组分为一胎和二胎两个胎次。采集分离枸橼酸钠抗凝血浆,使用CA-1500型凝血仪检测D-二聚体水平。结果重庆地区汉族女性晚孕期血浆D-二聚体参考区间细分:一胎者D-二聚体水平小于或等于2.75mg/L,二胎者D-二聚体水平小于或等于3.47mg/L(18～<35岁)及小于或等于3.95mg/L(35～45岁)。结论本研究建立了与年龄及生育次数相关的重庆汉族女性晚孕期血浆D-二聚体参考区间。

触珠蛋白在急性心肌梗死患者血清中的表达

目的探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路。方法收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达。结果 AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似;MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P<0.05)。结论 Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物。

表皮葡萄球菌生物膜形成机制及调控

表皮葡萄球菌已成为目前医源性感染的重要病原体,其致病性得到人们的广泛关注。通过研究发现,表葡主要通过对进入体内的医源性植入物的黏附、聚集、增殖形成有层次的功能性生物膜,把细菌包裹在内,这样细菌不仅可以逃避宿主的免疫损伤,还可以抵御多种抗生素作用。为了保证生物膜的稳定性,表葡还有agr系统,控制生物膜中细菌的数量,当生物膜足够厚时,agr系统就会通过多种方式使表面的生物膜部分脱落,并播散到宿主的其它器官或组织引起感染的扩散。除此之外,表葡之所以成为医源性感染的重要病原体,还有一个原因就是它具有灵活多变的基因,是自然界多种细菌基因的"储存库",它们通过不断的基因片段的传递,使耐药基因等在表葡中广泛传播。