特异性靶向巨噬细胞表达PR39的重组腺病毒抗胞内菌感染能力检测

目的检测巨噬细胞靶向表达PR39的重组腺病毒Ad-SP/PR39在抗胞内菌方面的作用。方法重组腺病毒Ad-SP/PR39经CsCl密度梯度离心纯化,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GPF的表达并检测重组腺病毒的滴度。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR-75-30和非洲绿猴肾细胞株COS-7后,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。将含Ad-SP/PR39的RAW264.7细胞裂解液作用于减毒结核分枝杆菌(BCG),检测其体外杀灭结核杆菌BCG的能力。另取RAW264.7细胞,吞噬BCG后,加入Ad-SP/PR39感染该细胞并检测细胞内活菌量,以观察其细胞内杀菌作用。结果经纯化后的重组腺病毒滴度可达5×1011efu/ml,能够有效感染小鼠巨噬细胞RAW264.7等多种细胞株。RT-PCR及免疫细胞化学技术检测各株细胞转录水平表达情况显示小鼠巨噬细胞RAW264.7能高效表达抗菌肽PR39,而其他细胞株几乎没有表达。与感染对照腺病毒Ad-C的RAW264.7细胞相比,转染Ad-SP/PR39的细胞显示出了更强的抗菌活性[BCG活菌数分别为(8.5±1.4)×106、(6.9±1.8)×106cfu/ml,P<0.05)],且能有效吞噬并杀灭胞内菌。结论本课题组构建的重组腺病毒能够靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因,发挥抗胞内菌作用,为抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用开辟了新思路。

PKCα活性在膀胱癌BIU-87细胞增殖中的作用及其机制

目的:探讨使用蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)特异性抑制剂Safingol抑制其活性后对膀胱癌BIU-87细胞增殖能力的影响。方法:应用PKCα抑制剂Safingol、PKCδ特异性抑制剂Rottlerin和PKC激活剂PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)处理人膀胱癌BIU-87细胞,通过MTT法检测细胞增殖能力,RT-PCR及Western印迹法检测立早基因c-fos和c-jun mRNA和蛋白的表达,FCM检验细胞周期的改变。结果:PKCα特异性抑制剂Safingol可明显抑制人膀胱癌BIU-87细胞的增殖并呈剂量依赖性;而PKCδ特异性抑制剂Rottlerin则无此作用,但能提高BIU-87细胞的增殖能力;PKC激活剂PMA则能明显增加BIU-87细胞的增殖能力;FCM检测结果显示,抑制PKCα的活性可使细胞阻滞于G0/G1期;RT-PCR及Western印迹法检测结果表明,c-fos与c-jun的表达与PKCα的活性相关。结论:抑制PKCα活性可明显抑制膀胱癌细胞的增殖能力,其作用机制可能与抑制c-fos和c-jun的表达有关。

尿胰蛋白酶原-2电流型免疫生物传感器的研究

目的:研制一种检测尿胰蛋白酶原-2(Urinary Trypsinogen-2,TSG-Ⅱ)的新型电流型免疫生物传感器。方法:将Nafion吸附到玻碳电极表面,并通过静电吸附和共价键合作用将硫堇和纳米金进行层层自组装,然后通过形成的纳米金单层吸附TSG-Ⅱ抗体,最后用辣根过氧化物酶封闭电极上的非特异吸附位点。结果:该免疫生物传感器对TSG-Ⅱ的响应特性良好,其线性检测范围为6.0～100μg/L;检出限为3.5μg/L。结论:该电流型免疫生物传感器具有灵敏度高、特异性好等优点,为建立一种检测TSG-Ⅱ新方法奠定了基础。