全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征，为神经元损伤的早期干预和继发性脑损害的防治提供实验依据。方法 建立大鼠全脑缺血模型，采用TTC染色、原位细胞凋亡检测（原位末端标记法，TUNEL）及AO／EB荧光比色法观察脑缺血再灌后海马、皮层凋亡发生的数量和分布，用荧光指示剂Fura-2 AM标记，检测脑海马细胞内游离钙的浓度。结果 TUNEL显示再灌注3h海马部位即出现散在凋亡细胞，并向皮层区域扩展，24—48h达高峰；坏死细胞迟于凋亡出现，弥散分布于凋亡细胞周围，再灌注48h后坏死细胞增多，72h最多。AO／EB法显示海马、额叶和顶叶凋亡细胞总数分布在再灌注后24h和72h达高峰，并显著高于对照组（P〈0．05）。TTC染色证实全脑缺血再灌注后不出现梗死灶，而是在海马及大脑皮层有弥散性坏死。胞内[Ca^2＋];各时间点与对照相比匀显著升高（P〈0．01）。结论 全脑缺血再灌后受累神经元经历了由凋亡到死亡的过程，对缺血敏感的海马神经元首先受损，并向顶叶和额叶皮层扩展，细胞质内[Ca^2＋]i增加是主要原因。利用凋亡时间窗进行早期干预可能有益于保护和挽救凋亡前期神经元，减小继发性损害的严重程度。

T2DM患者空腹血浆视黄醛结合蛋白-4水平及对罗格列酮治疗的反应

目的:测定2型糖尿病(T2DM)患者空腹血浆视黄醛结合蛋白-4(RBP-4)浓度,并观察罗格列酮对血浆RBP-4的影响.方法:34例单用二甲双胍降糖治疗效果欠佳的T2DM患者(T2DM组)加用罗格列酮4mg/d治疗12wk.30例新近诊断未使用任何降糖药物的初发T2DM患者(nT2DM组).检测nT2DM组及T2DM组治疗前后的体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、血压、体脂含量(FA)(%)等.采用放免法测定血浆RBP-4水平和胰岛素水平;酶法检测血糖和血脂;高压液相法检测糖基化血红蛋白(HbA1c),计算胰岛素抵抗指数(HO-MA-IR)和分泌指数(HOMA-IS),评价各个代谢指标与血浆RBP-4的相关性.结果:T2DM组RBP-4水平高于nT2DM组[(20.40±0.99)vs(16.94±0.78)mg/L,P<0.01].罗格列酮治疗后,患者游离脂肪酸(FFA)、HbA1c、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)、HOMA-IR(均P<0.01),空腹胰岛素(FIns)显著降低(P<0.05).但RBP-4水平变化差异无统计学意义.空腹血浆RBP-4水平与性别(r=0.292,P=0.019)、三酰甘油(TG)(r=0.287,P=0.021)和2hPIns(r=0.329,P=0.008)显著相关.多元逐步回归分析结果表明,2hPIns是影响血浆RBP-4水平的独立相关因素.结论:初发T2DM患者RBP-4水平明显低于血糖控制不佳的T2DM患者,罗格列酮治疗可以降低血糖控制不佳T2DM患者血糖,改善胰岛素敏感性,但未明显改变血浆RBP-4水平.

老年2型糖尿病瘦素、骨密度变化及相关因素的研究

目的探讨老年2型糖尿病(T2DM)患者骨密度变化及其与瘦素、性激素及各种骨转换因子的相关关系。方法采用单能定量CT(QCT)对53例2型糖尿病患者及40例健康老年人进行脊柱骨密度(BMD)测定,并分析受试者的骨密度与体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、血清瘦素(leptin)、性激素、骨钙素(BGP)、骨特异性碱性磷酸酶(B-ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)等指标间的关系。结果①T2DM组脊柱BMD均值显著低于对照组(P<0.05),T2DM组血浆瘦素浓度较对照组显著升高(P<0.05)。②相关性研究显示,T2DM组瘦素水平与L1椎体及脊柱BMD均值呈显著负相关(r=-0.443,r=-0.373,P<0.05)。③多元线性回归分析表明,T2DM组中瘦素、E2、T分别是BMD变化的独立相关因素。结论老年2型糖尿病患者存在不同程度的骨密度下降。瘦素是老年T2DM患者骨量减少的影响因素,但不是直接因素。

用积分法测定血清芳香酯酶活性

目的 以血清芳香酯酶 (ArE)为模型 ,用模拟和实验考察积分法测定酶活性的可靠性。方法 用酚乙酸酯测定ArE反应曲线。按ArE的积分速度方程In(S0 /Si) +(S0 -Si) /Km=(Vm/Km)×ti 计算无误差反应曲线 ,叠加随机误差得模拟曲线。以底物浓度 (S0 )为参数用Equ① 非线性拟合测定Vm/Km,换算得Vm。结果 模拟表明积分法测定酶活性与S0 无关 ,升高S0 可提高测定上限。实验表明S0 低于Km 的 2 0 %时Vm/Km 无变化 ;重复性 5 8%(ν =6) ;本底和反应起点延迟无干扰 ;升高S0 可提高上限。此积分法用 2 0 %Km 的S0 测定 86份血清 ,ArE活性Vm 呈正态分布 ,与据初速度按米氏方程计算的Vm 无差异。结论 此积分法能可靠测定酶活性Vm/Km 或Vm。

糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定

目的构建糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合域的诱饵表达载体。方法RT-PCR扩增GR结合域,克隆入pMD18-T,测序正确后,再亚克隆入诱饵载体pGBKT7中,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了GR结合域,并分别成功克隆到pMD18-T和pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了GR结合域的酵母诱饵表达载体。

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用。COX-2mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%。结论成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达。

肺炎链球菌双组份系统中的组氨酸激酶(YycG)的同源模建与分析

对肺炎链球菌双组份系统中的组氨酸激酶YycG进行同源模建,并分析其与底物ADP的相互作用,为寻找特异性的激酶抑制剂提供了理论依据。采用同源模建的方法构建YycG蛋白的三维结构,并用ProCheck、Profile_3D软件对此结构模型的合理性进行验证;用Autodock4.0软件将结构模型与ADP进行自动对接,分析二者之间的相互作用。序列比对结果显示肺炎链球菌YycG蛋白与Thermotoga maritima X-ray晶体结构序列的同一性达33%;YycG模建后的结构与模板能很好的叠合;在活性口袋处的保守的氨基酸残基Asn145、Asn149、Lys152以及口袋内部的疏水残基在结合、水解底物ADP的过程中发挥重要作用。组氨酸激酶YycG的模建合理,该结构模型可作为设计抗菌药的研究起点。

组氨酸激酶(YycG)在筛选肺炎链球菌抑制剂中的应用

为了获得具有体外活性的肺炎链球菌组氨酸激酶YycG并利用其筛选寻找新的抑制剂。原核表达组氨酸激酶YycG的激酶功能域,经SDS-PAGE,Western blot鉴定及镍层析柱纯化后,采用激酶试剂盒检测其激酶活性;利用对其激酶活性的抑制作用从105种候选化合物中筛选有效的抑制剂,并通过实验验证抑制剂的抗菌作用。原核表达得到约35kDa的目的蛋白激酶域片段YycG′,其纯度达95%,并具有体外水解ATP的激酶活性;利用其活性筛选得到数种不同抑制效果的小分子化合物,且体外验证具有较好的抑菌效果。通过肺炎链球菌组氨酸激酶YycG活性筛选找到的小分子抑制剂可为进一步研发与该菌相关的药物或消毒剂提供基础。

利拉鲁肽改善非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脂肪沉积的机制探讨

目的 探讨利拉鲁肽改善肝脏脂肪沉积的潜在分子机制.方法 8周龄雄性C57BL/6J小鼠标准饲料喂养作为野生对照组（WT组,n=10）;ApoE KO小鼠56只,随机分为标准饲料喂养组（ApoE KO组,n=10）、高脂喂养组（HF组,n=10）、高脂喂养＋空载腺病毒组（Ad-shGFP组,n=6）、高脂喂养＋脂联素RNM腺病毒组（Ad-shAcrp30组,n=10）、高脂喂养＋脂联素RNAi腺病毒＋利拉鲁肽组（Liraglutide组,n=10）、高脂喂养＋脂联素RNAi腺病毒＋等渗盐水组（Saline组,n=10）.共喂养16周,于14和15周末给予Ad-hGFP组和Ad-hAcrp30组尾静脉分别注射Ad-shGFP和Ad-shAcrp30重组腺病毒（1×1010/ml）.Liraglutide组第9周开始腹腔注射利拉鲁肽（1mg/kg,2次/d）.16周末测血浆葡萄糖、血脂、脂联素及胰岛素等.取肝脏组织做HE染色及油红O染色.荧光实时定量PCR检测基因mRNA表达、蛋白免疫印迹Western blot检测相关蛋白表达.非正态分布数据采取自然对数转换.组间比较采用方差分析,组内比较采用SNK法.结果 与Ad-shGFP组相比,Ad-shAcrp30组脂肪组织脂联素mRNA、蛋白表达及血浆脂联素水平均降低（均P＜0.01）;HF组的空腹血糖（FBG）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）较WT组及ApoE KO组均显著升高（均P＜0.01）,给予Ad-shAcrp30后,FBG、TC、TG、FFA进一步升高.Ad-hAcrp30组肝脏TC及TG含量较HF组升高（P值均＜0.05）.油红O染色见Ad-shAcrp30组肝内大量脂滴沉积,HE染色示Ad-shAcrp30组肝小叶结构紊乱.与Saline组相比,Liraglutide组体质量、血糖、血脂及ALT均显著降低（均P＜ 0.01）;脂肪组织脂联素蛋白表达及血浆脂联素水平均显著升高（均P＜ 0.01）;肝脏TG、TC均减少（P值均＜0.05）;油红O染色提示肝脏脂滴明显变小,且数量减少;肝脏ACC、FAS表达下调,而磷酸化AMPK蛋白表达增加（P＜ 0.01）.结论 利拉鲁肽可以显著改善高脂喂养联合低脂联素血症诱导的代谢紊乱并减轻肝脏脂质沉积.