实验诊断教学改革探讨

为了提高实验诊断学的教学效果，培养高素质医学人才，我们对实验诊断教学进行了改革，理论课适当补充书本上没有的新进展，注重临床分析问题的培养，加强专业外语的学习。实验课设置与临床一致的实验项目。结果：97医疗系、预防医学系98%学生对这些改革举措满意，并受到同行好评。

实验诊断学实验课教学中的素质教育

实验诊断学是一门联系基础与临床的医学桥梁课程,其中实验课教学是理论课教学的重要补充和扩展。对如何充分利用实验诊断学的实验课小班教学的优势,通过一些实验项目的开展和教师的言传身教,培养学生良好的实验室习惯和作为一个医学生应该具有的责任感和使命感等素质教育问题进行了思考,并对多年的实验教学经验进行了总结。

实验诊断教学的体会

实验诊断是基础与临床之间的桥梁学科，是研究诊断疾病方法的学科，随着医学科学技术的发展，实验室检测项目的增多，方法更新快，学科之间交叉渗透知识更为广泛，如何搞好这门课的教学。通过近20年来的教学实践，有以下几点体会。

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的 分离纯化细胞角蛋白 2 0 (Cytokeratin2 0 ,CK2 0 )并加以鉴定 ,为进一步研制抗CK2 0单克隆抗体奠定基础。方法 培养人膀胱肿瘤T 2 4细胞系并用免疫组化检测CK2 0表达 ,然后大量培养并收集细胞 ,超声波细胞粉碎后 ,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离 ,然后利用以DE5 2为介质的阴离子交换层析分离纯化CK2 0蛋白 ,以电泳示踪 ,最后采用SDS PAGE、HLPC和Western blotting加以鉴定。结果 在阴离子交换层析时出现 3组洗脱峰 ,CK2 0主要存在第二组峰中 ,该峰在SDS PAGE和Western blotting上均呈现单一条带 ,HLPC分析显示CK2 0蛋白主峰呈正态分布 ,仅见一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论 该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高 ,提取的蛋白可确认为CK2 0并且具有较高的免疫生物活性。

临床检验基础专业课课堂教学方法探讨

临床检验基础课程涉及的内容繁杂枯燥、缺乏系统性和连贯性,学生上课缺乏主动获取知识的兴趣,如何提高《临床检验基础》专业课的课堂授课质量,笔者归纳为:教学内容重点突出;教学内容适当更新;提高讲课吸引力。

尿液端粒酶催化亚基mRNA检测与膀胱肿瘤的诊断

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一 ,近年来发病率有增高的趋势 ,早期诊断是提高治疗效果的关键 ,另外膀胱肿瘤复发率高 ,10 %～ 2 0 %的复发肿瘤会发展到更高级和肌层浸润。国内外大量研究文献证实 ,端粒酶的激活与肿瘤的发生、发展有关 ;而端粒酶催化亚基 (hTERT)在调节端粒酶活性中起决定作用。现就尿液hTERT及其在膀胱肿瘤的早期诊断、复发监测和预后判断等方面的价值作一综述。

检验专业实习带教尝试

临床实习是检验专业教学内容的重要部分,它是理论教学的延伸与补充,又具有独立的教学规律,是培养学生理论联系实际、锻炼工作能力和提高学生素质的重要环节。但是多数学校检验专业学生实习是依靠实习基地老师而没有固定的专业教师带教,缺乏在整体宏观上对实习教学内容的进一步指导,为达到我国《高等教育法》规定的'本科学生应掌握本专业必要的基本技能方法和相关的知识,具有从事本专业实际工作和研究工作的初步能力'。为提高实习教学的质量。

榄香烯对人肺腺癌细胞A549作用机理的初步研究

目的:研究榄香烯对体外培养的人肺腺癌细胞株A549的作用及其机制。方法:采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期变化以及电镜观察细胞的形态变化。结果:榄香烯能明显抑制肺腺癌细胞A549的生长,其半数生长抑制剂量为124.61μg/ml;流式细胞术证实榄香烯能阻滞肺腺癌细胞从S期进入G2/M期;透射电镜超微结构可见细胞浆内脂滴增多和坏死细胞明显增多的形态变化。结论:榄香烯能抑制肺腺癌细胞的生长,并阻滞肺腺癌细胞从S期进入G2/M期。

大蒜素及缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及机制研究

目的:探讨缺血预处理和大蒜素注射液预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。将75只SD大鼠随机分成对照组(Control group,CON组)、缺血再灌注组(Ischemia reperfusion,IR组)、缺血预处理组(Ischemic preconditioning group,IPC组)、大蒜素预处理组(Allitride preconditioning group,APC组)、大蒜素及缺血预处理(Allitridpreconditi oning and ischemic preconditioning group,AIPC组)共5组,每组15只。各组均于术后24h采集肾组织及血样标本,用HE法观察肾组织病理形态、测定血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,Cr)含量、TBA法测定丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;免疫组化法观察肾组织中粘附分子(Interce llular adhesionmolecule-1,ICAM-1)的表达。结果:IPC或APC后HE染色坏死较IR组减少,BUN、Cr、MDA含量较IR组下降(P<0.01),SOD活性较IR组升高(P<0.01),肾组织ICAM-1表达较IR组下降(P<0.01)。AIPC处理后各项指标较IPC或APC单一处理有显著区别(P<0.01)。结论:缺血预处理和大蒜素预处理对肾缺血再灌注有保护作用,两种处理因素对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护有协同作用,可能是通过下调ICAM-1的表达实现的。

TGF-β1基因特异性shRNA真核表达载体的构建及其基因抑制作用

目的:构建针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体并评价其在人脐静脉内皮细胞株中对TGF-β1基因的抑制作用,筛选出高效的表达载体以用于后续的RNAi研究。方法:利用生物信息学方法设计shRNA,在人TGF-β1基因的mRNA序列中选择靶序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒。构建2个表达载体PGenesil-TGF-β1-1(pT11)和PGenesil-TGF-β1-2(pT12),酶切及测序证实后转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中,错构载体(pHK)为阴性对照。转染后采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TGF-β1mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TGF-β1蛋白质的表达。结果:酶切及测序证实表达载体pT11、pT12构建成功,两个表达载体的转染率为38.2%和40.1%,两个表达载体对人脐静脉内皮细胞株TGF-β1基因的转录抑制率为58.1%和60.0%,蛋白表达抑制率为38.9%和44.3%。结论:成功构建的针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体对脐静脉内皮细胞株TGF-β1基因的转录有明显的抑制作用,并以表达载体pT12的效果为优,为后续移植肾肾病基因治疗的研究奠定了基础。

PLCε siRNA转染对膀胱癌细胞株T24侵袭能力的影响

目的:研究磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)siRNA表达质粒的转染对人膀胱癌细胞系T24侵袭转移能力的影响。方法:分别将携有PLCεsiRNA基因的真核表达质粒两对p11-PLCε和p12-PLCε载体体外转染T24细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PLCεmRNA的表达情况,应用Transwell小室侵袭试验、明胶酶谱分析分别研究转染前、后膀胱癌细胞侵袭转移能力的变化,并以空载质粒HK-A转染和未转染细胞为对照。结果:RT-PCR检测显示pll-PLCε,p12-PLCε转染成功后T24细胞PLCεmRNA表达明显比空质粒HK-A转染和未转染细胞减弱;p12-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(26.8±5.8)和pll-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(25.8±6.2)明显少于未转染细胞(34.8±6.9)和HK-A转染细胞(33.8±5.7)(P<0.01);明胶酶谱分析显示转染pll-PLCε、p12-PLCε均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于未转染细胞和HK-A转染细胞。结论:推测转染外源性PLCεsiRNA基因能下调PLCε基因的表达并能抑制膀胱癌细胞侵袭转移。

膀胱移行细胞癌尿脱落细胞和血细胞中hTERT及c-myc的表达

目的 :探讨hTERT和c mycmRNA在膀胱移行细胞癌 (TCC)患者尿脱落细胞和外周血细胞的表达、临床意义及关系 .方法 :采用RT PCR法同时检测膀胱肿瘤细胞株 ,2 8例TCC患者和 15例正常对照尿脱落细胞和外周血的hTERT和c mycmRNA表达 .结果 :尿脱落细胞hTERT和c myc阳性表达率分别为 85 .7%和 71.4 % ,对照组为 13.3%和 2 6 .7% ;血细胞两指标的阳性表达率分别为 78.6 %和 5 7.1% ,对照组为 6 .7%和 33.3% ;肿瘤组与对照组比较具有显著性差异 (P <0 .0 1) ,两指标不同组间比较具有相关性 (P <0 .0 1) .结论 :hTERT和c mycmRNA在TCC中的表达具有相关性 ;二者可作为膀胱癌的良好诊断指标 ,hTERT较c myc特异和灵敏 ;

膀胱肿瘤中端粒酶催化亚基(hTERT)的表达

目的:探讨端粒酶催化亚基(hTERT)基因与膀胱移行细胞癌(TCC)生物学行为的关系。hTERTTCC方法:采用法RT-PCR检测例组织,例癌旁组织和例正常膀胱粘膜组织的表达,分析与临床分期、病理分化程度、浸润程27TCC1616hTERTTCC度、肿瘤复发等生物学行为的关系。结果:组织中表达的阳性率为(),而癌旁组织的阳性率为100%27/2737.5%(),正常膀胱粘膜的阳性率为,三者比较在统计学上具有显著性差别(6/160P),但在不同临床分期、病理分级的<0.01组织及浸润、复发和多发肿瘤的表达阳性率差别不具统计学意义(TCChTERTP)。 >0.05结论:本实验结果表明组织中TCC表达阳性率明显高于癌旁组织和正常膀胱粘膜的表达,可以作为特异和灵敏的诊断与鉴别诊断的肿瘤标志hTERThTERTTCC物,但与的不同临床分期、病理分级、肿瘤浸润和复发等生物学行为未见相关性。

膀胱癌患者尿液脱落细胞Livin检测的临床意义

目的探讨膀胱癌患者尿液脱落细胞中Livin的表达及临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测52例膀胱癌患者,18例泌尿外科非肿瘤患者以及10例健康志愿者尿液脱落细胞Livinα和β的表达,以-βactin为内参照。结果52例膀胱癌患者42例尿液脱落细胞Livinα表达阳性,阳性率86.5%,而Livinβ均表达阴性;18例泌尿外科非肿瘤患者及10例健康志愿者Livinα及β均表达阴性。结论检测膀胱癌患者尿液脱落细胞Livinα的表达,敏感性和特异性均较高,可作为临床筛选膀胱癌的理想指标。

3～18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖

目的:在分离、纯化、培养3～18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3～18周胎龄NSC的增殖特点。方法:从3～18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3～6周龄),B组(7～11周龄),C组(12～18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况。结果:从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P<0.05)。结论:3～18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱。

人端粒酶催化亚基启动子联合mad1基因体外抑制膀胱癌细胞的研究

目的探讨人端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子联合mad1基因对膀胱癌细胞T24和EJ细胞的生长抑制作用及机制。方法采用细胞计数、电子显微镜、流式细胞术、RT-PCR及免疫组化等方法,观察hTERT启动子联合mad1基因表达质粒转染T24和EJ细胞后的膀胱肿瘤细胞的增殖能力、生长周期、细胞超微结构的变化以及hTERT和TGF-β1mRNA基因和蛋白表达影响。结果转染hTERT启动子联合mad1基因后对T24和EJ细胞生长有明显抑制作用、出现凋亡小体和细胞周期相的改变,S期细胞明显减少,G0/G1期细胞明显增多,下调T24和EJ细胞hTERT和TGF-β1的mRNA表达,并能抑制hTERT和TGF-β1蛋白表达。结论hTERT启动子联合mad1基因能够抑制膀胱肿瘤细胞的增殖能力,可望为膀胱癌基因治疗提供新思路。

细胞角蛋白20单克隆抗体免疫胶体金试纸条的研制

目的研制用于尿液检查的细胞角蛋白20单克隆抗体免疫胶体金试纸条(CK20试条),建立一种无创性筛选诊断和检测膀胱癌复发的新的检测手段。方法将经处理的CK20单抗标记在胶体金颗粒上并活性进行鉴定,合格后吸附在硝酸纤维膜上并固定在长方形硬质塑料胶片一端为测定线;同时将吸附有IgG蛋白胶体金的硝酸纤维膜固定在测定线的一侧为质控线。将制成的CK20试条吸样端浸入尿液测定。结果成功的制备CK20试条,初步临床用于膀胱癌检测,敏感性78%(39/50),特异性为87%。结论采用该方法制备的CK20试条对膀胱癌患者尿液的检测具有较好的灵敏度和特异性,可用于膀胱癌瘤患者筛检诊断和复发的检测。

特异性O1群稻叶型霍乱弧菌单克隆抗体的制备、筛选及识别抗原表位的分析

目的制备并筛选出高特异性高活性的抗O1群稻叶型霍乱弧菌(Vibrio cholerae O1 Serotype Inaba)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为霍乱的预防诊断提供有力的抗体工具。方法应用杂交瘤技术,通过灭活的O1群稻叶型霍乱弧菌免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合制备特异性McAb,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行了特异性及排除性筛选,对筛选出的特异性McAb进行了包括亚型鉴定,效价、亲和常数的测定以及特异性的鉴定与分析,并通过单克隆抗体的位点相加实验、与O1群稻叶型霍乱弧菌脂多糖(LPS)的间接ELISA和Western blot实验对McAb识别的抗原表位进行了初步分析。结果融合了386株能分泌抗O1群稻叶型霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株,通过用O1群小川型、O139霍乱弧菌及9种非霍乱弧菌的细菌进行的筛选,最后得到4株能稳定分泌特异性的针对该McAb的细胞株,其分泌的抗体亚类分别为2株IgG1,1株IgG2a,1株IgG2b;腹水效价均达10-6;亲和常数达108以上。间接ELISA法及Western blot证实所获的McAb可与O1群稻叶型霍乱弧菌发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示4株McAb识别不同的抗原表位,与LPS的反应表明其中2株针对O1群稻叶型霍乱弧菌脂多糖,2株针对非脂多糖抗原位点。结论获得霍乱弧菌O1群稻叶型特异性McAb,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。

肝癌细胞线粒体蛋白的MALDI-TOF质谱鉴定方法研究

目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略。方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)混匀后进行MALDI-TOF MS分析;对来源于人肝细胞癌细胞株QGY-7703线粒体的差异表达的候选蛋白点L9,按照通过BSA标准蛋白优化的条件进行MALDI-TOF质谱鉴定;其肽质量指纹图(PMF)经MS-Fit检索。结果:经数据库检索,BSA的肽质量指纹图(PMF)匹配肽质量数为10/11,序列覆盖率为19%,说明实验条件完全可信。候选蛋白点L9的PMF数据经数据库检索后,排名前两位的蛋白均为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor),其匹配肽段为9/13,序列覆盖率为24%;且OXCT的理论分子量(56kda),理论等电点(7.1),与胶上L9蛋白的位置相符。故候选蛋白点L9确认为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor)。结论:本文所确定的鉴定策略适用于线粒体比较蛋白质组学的研究。

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白。方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%。结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础。