间变性淋巴瘤激酶与神经母细胞瘤关系的研究进展

神经母细胞瘤(neuoblastonma,NB)是小儿最常见的实体肿瘤之一,临床表现变异较大,高危NB进展迅速,即使行高强度清髓化疗,肿瘤复发仍然常见,死亡率较高为发现有效NB治疗药物和靶点,必须充分研究认识NB发病机制中的关键分子。间变性淋巴瘤激酶(ALK)是一种受体型酪氨酸激酶,其异常存在于多种肿瘤中,与肿瘤发生发展密切相关,如间变性大细胞淋巴瘤、横纹肌肉瘤、炎症性肌纤维母细胞瘤、NB。ALK的异常形式主要包括基因融合、基因突变、基因扩增及蛋白表达增加随着酪氨酸激酶抑制剂在临床抗肿瘤治疗中的应用以及新的特异性小分子ALK抑制剂的研发,ALK异常与NB发生发展关系及针对ALK异常的NB靶向治疗获得了较多关注和研究。

丝氨酸羟甲基转移酶1基因C1420T位点和3'-非翻译区3个位点单核苷酸多态性与儿童急性白血病易感性的关系

目的研究深圳地区汉族儿童丝氨酸羟甲基转移酶1（SHMT1）基因C1420T位点和3’-非翻译区（UTR）3个位点单核苷酸多态性（SNP）与急性白血病（AL）易感性的关系。方法以110例AL患儿、120例上呼吸道感染患儿和健康体检儿童为研究对象，用PCR、变性梯度凝胶电泳（DGGE）及DNA测序检测研究对象SHMT1 C1420T（rs1979277）和3’-UTR3个位点（rs3783、rs1979276及rs12952556）基因型和等位基因频率，分析其与AL易感性的关系。结果AL患儿SHMT1编码区C1420T位点CT（杂合型）和TT（纯合型）基因型频率较对照组升高（17．3％vs10．8％和1．8％vs1．7％），但差异无统计学意义（Х^2分别为2．006和0，P均〉0．05）；CT和TT基因型与儿童AL发病风险无相关性，其风险比（OR）分别为0．580（0．271—1．240）、0．848（0．117～6．140）。3’-UTR rs3783、rs1979276及rs12952556与C1420T具有相同的基因型分布状态，即在同一个体内该4个位点同为野生、杂合或纯合型基因。经SNPStats在线软件分析，该4个SNP位点两两间的连锁不平衡系数均为D’=1和r^2=1。结论深圳地区汉族儿童SHMT1个位点SNP与AL易感性无关，但可能呈完全连锁不平衡。

急性白血病患儿TYMS编码区单核苷酸多态性分析

目的探讨TYMS编码区单核苷酸多态性(SNP)在急性白血病(AL)患儿和对照儿童中的等位基因频率和基因型分布特征及其与中国汉族儿童AL发生风险的关系。方法用RT-PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)结合DNA直接测序技术筛查108例AL儿童和121例对照儿童的TYMS基因编码区开放阅读框的全部SNP及基因突变,分析等位基因频率及各基因型在两组人群中的分布,并进行病例、对照优势比分析以研究各SNP位点与AL发生之间的关系。结果在中国汉族儿童TYMS开放阅读框中仅筛查到2个SNP,分别为A381G和T349C。TYMS A381G各基因型在AL组的频率分布为:AA型76.8%(83/108);AG型20.4%(22/108);GG型2.8%(3/108);在对照组中各基因型频率为:AA型79.4%(96/121);AG型16.5%(20/121);GG型4.1%(5/121)。A381G(Glu127Glu)在AL患儿及对照儿童中的等位基因频率分别为13.0%和12.4%。在中国汉族儿童发现T349C(Phe117Leu)的存在,其等位基因频率为1.2%。结论 TYMS A381G与AL发生风险可能无相关性;中国汉族儿童TYMS基因存在T349C多态位点。

儿童神经母细胞瘤中ALK基因突变的研究

目的探讨中国儿童神经母细胞瘤(NB)中间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的突变情况。方法从22例石蜡包埋的NB肿瘤组织中提取基因组DNA,通过PCR-DNA直接测序技术分析儿童NB肿瘤组织中ALK突变热点区域第20～26号外显子的突变情况。结果 22例儿童NB中,有10例(46%)在ALK第21号外显子上存在已知同义突变C3375A(Gly1125Gly),等位基因频率为27%;1例(5%)在ALK第23号外显子上发现一个新的同义突变C3586T(Leu1196Leu)。ALK突变C3375A的发生频率在NB患儿的年龄、性别、肿瘤分化程度和是否转移方面差异无统计学意义(P>0.05)。在其他5个ALK外显子中未发现突变。结论采用PCR-DNA测序技术发现了ALK一个新的同义突变C3586T,并证实了儿童ALK存在已知突变C3375A,其发生率不受NB患儿临床特征的影响。

哮喘患儿诱导痰辅助性T细胞亚群及相关细胞因子变化研究

目的探讨支气管哮喘患儿诱导痰中辅助性T细胞(Th)亚群及相关细胞因子的变化及意义。方法观察2009年9月至2010年1月深圳儿童医院收集的20例哮喘患儿及20例同年龄对照组儿童,采用流式细胞术检测哮喘患儿外周血Th1、Th2、Th17、CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)数量;同时收集哮喘患儿和对照组儿童的诱导痰,进行炎性细胞计数与分类,荧光定量聚合酶链反应(RealTimePCR)测定外周血单个核细胞及诱导痰T-bet、IFN-γ、GATA3、IL-4、Foxp3、TGF-β、RORrt、IL-17A、IL-8、TNF-α等mRNA表达水平。结果 (1)急性期哮喘患儿外周血Th1、Treg细胞比例降低(P<0.05)、Th2细胞、Th17细胞比例与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)急性发作期哮喘患儿外周血单个核细胞T-bet、Foxp3、IFN-γ、TGF-β表达降低(P<0.05),GATA3、RORγt、IL-4、IL-17A与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)急性发作期哮喘患儿诱导痰中性粒细胞、嗜酸性粒细胞数量增加(P<0.05)。(4)急性发作期哮喘患儿诱导痰中RORγt、IL-17A、GATA3、IL-4、IL-5、IL-8、TNF-α表达增高(P<0.05),T-bet、IFN-γ、Foxp3、TGF-β表达与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论哮喘患儿诱导痰Th2与Th17转录因子和细胞因子增多,可能是导致儿童哮喘气道炎症反应的重要原因。

脓毒症患儿血浆微RNA表达及其与炎症细胞因子的相关性

目的探讨儿童脓毒症患者血浆微RNA（miRNA）的表达及其与炎症细胞因子的相关性和临床意义。方法选取2012年4月至2013年3月深圳市儿童医院儿童重症监护病房（PICU）住院的40例脓毒症患儿为研究对象，其中男27例、女13例，中位年龄0．75（0．52，1．90）岁，其中严重脓毒症16例。选取20例手术后全身性炎症反应综合征（SIRS）患儿和15名健康儿童分别作为SIRS组和对照组，通过实时荧光定量PCR（qRT—PCR）方法检测血浆miR-21、miR-125b、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223表达量。受试者工作特征曲线（ROC）评价表达差异的血浆miRNA、降钙素原（PCT）和c反应蛋白（CRP）等指标对脓毒症的预测价值。利用流式液相多重蛋白定量技术（CBA）检测患儿血浆肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-10水平。正态分布的多组计量资料采用单因素方差分析，以LSD-t检验进行组间两两比较。非正态分布的资料多组间比较采用Kmskal—Wallis日检验，两组问采用Mann—WhitneyU检验。结果各组间年龄、性别差异均无统计学意义，具有可比性。各组血浆miR-21、miR-12513、miR-132、miR-155表达水平差异均无统计学意义（均P〉0．05）。脓毒症组miR-146a、miR-223表达水平均高于SIRS组和对照组[（5．7±3．5）×10^-5比（2．4±1．6）×10^-5和（2．6±1．2）×10^-5，（12．5±7．7）×10^-4比（8．3±3．4）×10^-4和（5．3±2．2）×10^-4，均P〈0．01]，SIRS组miR-223水平高于对照组（P〈0．01）。严重脓毒症组miR-146a表达水平较-般脓毒症组高[（7．1±3．3）×10^-5比（4．6±2．6）×10^-5，P〈0．01]。脓毒症组和SIRS组CRP、PCT水平均高于对照组，脓毒症组PCT高于SIRS组（均P〈0．05）。miR-146a、miR-223和PCT、CRP预测脓毒症的ROE曲线下面积（AUC）分别为0．815（95％C1：0．708-0．922），0．678（95％CI：0．537～0．818），0．706（95％CI：0．571～0．842）和0．588（95％CI：0．427～0．748）。脓毒症组血浆IL-10、IL-10／TNF—α水平均高于SIRS组和对照组（均P〈0．01），且IL-10、IL-10／TNF-α和miR-146a、miR-223水平均呈正相关（r=0．545、0．305和0．562、0．373，P=0．000、0．008和0．000、0．001）。结论脓毒症患儿血浆miR-146a、miR-223表达上调，与IL—10、IL-10／TNF—α水平正相关，有望作为脓毒症早期诊断和判断病情严重程度的标志物。

急性期川崎病患儿滤泡辅助性T细胞改变观察

目的 探讨滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）在儿童川崎病（Kawasaki disease,KD）中的数量变化及其可能机制.方法 急性期川崎病患儿20例,采用流式细胞术检测外周血CD4＋CXCR5＋ICOS＋T细胞（Tfh）的比例,采用real-time PCR检测转录调节因子Bcl-6、Blimp-1 mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测血浆中IL-4和IL-21浓度；20例同龄健康儿童作为对照组.结果 （1）急性期KD患儿Tfh细胞比例明显高于正常对照组[（2.6±0.6）％vs（1.8±0.7）％,P＜0.05]；（2）Tfh细胞转录因子Bcl-6 mRNA表达较正常对照组明显增高（P＜0.05）,其拮抗因子Blimp-1 mRNA表达降低（P＜0.05）；（3）血浆IL-21和IL-4蛋白浓度明显高于正常对照组（P＜0.05）.结论 Tfh细胞过度活化可能参与了KD免疫发病机制,Bcl-6/Blimp-1表达失衡,IL-4和IL-21细胞因子微环境改变可能与Tfh细胞异常活化有关.