肺癌细胞A549中过表达PRR11影响Vimentin组装

目的:探索富脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11,PRR11)过表达诱发染色体凝聚异常的分子机理。方法:综合利用瞬时过表达、si RNA敲减和免疫荧光染色方法在人肺癌细胞系A549中过表达或沉默PRR11后,检测波形蛋白(Vimentin)的表达与亚细胞分布及染色质凝聚异常情况。结果:肺癌细胞中内源性PRR11在胞浆中呈现弥散型分布,而Flag-PRR11过表达后在细胞中的分布呈现弥散状和网络状两种不同形态。进一步检测发现内源性或外源过表达PRR11与Ⅲ型中间丝蛋白Vimentin共定位,并且导致Vimentin绕核分布紊乱及染色质凝聚异常。结论:在细胞周期过程中PRR11与Vimentin共定位并调节其组装过程。推测PRR11异常表达可能通过与Vimentin共定位导致核骨架核纤层不稳定并诱发染色质异常凝聚,从而促进肿瘤的发生发展。

人ETV4蛋白截短体的构建与其在结直肠中的功能分析

目的:研究ETV4转录因子各保守结构在转录调节结直肠癌细胞增殖以及迁移过程中的作用以及机制。方法:利用PCR介导的克隆技术,在前期构建的ETV4载体基础上,构建含不同ETV4结构域的蛋白截短体ETV4(1~339)(包含酸性结构域)与ETV4(340~484)(含DNA结合结构域)。利用CCK-8试剂盒检测不同截短体对结直肠癌细胞增殖的影响,利用细胞划痕实验检测不同截短体对结直肠癌细胞迁移的影响。进一步利用定量PCR技术检测表达不同截短体过表达细胞中上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物的变化情况。结果:CCK-8实验结果显示截短体ETV4(1~339)无明显促进结直肠癌细胞增殖的作用,而截短体ETV4(340~484)和全长蛋白都可明显促进结直肠癌细胞增殖(P<0.01)。细胞划痕实验显示截短体ETV4(340~484)和全长蛋白可促进结直肠癌细胞迁移而截短体ETV4(1~339)却无此作用。进一步对EMT标志物检测发现ETV4(340~484)和全长蛋白可导致E-cadherin表达下降,N-cadherin、Vimentin和Twist表达上调(P<0.01),而ETV4(1~339)中EMT标志物无明显变化。结论:本实验首次证明,ETV4促进结直肠癌细胞增殖和迁移主要是通过ETV4中的ETS结构域起作用,并且可能通过介导EMT标志物来调控结直肠癌细胞转移。

基于酵母双杂交技术的PRR11相互作用蛋白筛选与初步分析

目的:采用酵母双杂交技术,筛选PRR11的相互作用蛋白,为深入研究其分子行为机制奠定基础。方法:构建用于酵母双杂交筛选的PRR11诱饵质粒并检测其自激活作用,根据结果进一步构建突变体获得具有较低自激活作用的突变体。对人胎脑cDNA文库进行筛选,获得初始阳性克隆。通过LacZ报告基因检测、回转验证、阳性克隆测序及BLAST序列比对分析,排除假阳性克隆和重复克隆,确定PRR11的候选相互作用蛋白。结果:PRR11具有自激活作用,构建了一个较低自激活作用的PRR11突变体。通过酵母双杂交筛选,获得102个初始阳性克隆转化子。经LacZ报告基因检测,将阳性克隆锁定至39个。通过测序和序列比对分析,证实这39个克隆属于编码15种不同蛋白的基因。最终有RNF41等4个蛋白通过回转验证。结论:RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13是PRR11的潜在相互作用蛋白。

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。