一个新的负性调控元件对乙型肝炎病毒X启动子启动作用的调节

目的在前期工作已证实HBV基因中的250～453nt为一个新的负性调控元件的基础上，探讨其对HBV X启动子（XP）启动作用的影响。方法构建含250～453nt的HBV X启动子驱动虫荧光素酶表达的质粒pNRE—XP，与表达海肾荧光素酶的质粒RL-TK共转染人肝癌HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶表达，RT—PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平的表达，并与相应对照组进行比较。同时，在含HBV全基因组的质粒LJ196上通过缺失突变的方法除去250～453nt片段，将其与反式提供C、P蛋白的质粒LJ96共转染HepG2细胞，RT—PCR检测X基因mRNA表达，并与对照组比较。结果该负性调控元件存在时，HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显低于对照组；逆转录聚合酶链反应中虫荧光素酶基因mRNA表达也低于相应的对照组。在LJ196上突变掉250～453tat后，X基因表达量高于对照组。结论该负性调控元件可下调HBV XP的启动作用，在HBV基因组上缺失掉该片段后XP驱动下的基因表达增加。

高脂饮食对大鼠脂肪肝胰岛素受体底物1、2表达的影响

目的探讨高脂饮食对大鼠脂肪肝胰岛素受体底物(IRS)1、IRS-2分子表达的影响。方法对8周高脂饲养(n=7)和正常饲养(n=7)大鼠的胰岛素敏感性、脂质代谢、肿瘤坏死因子(TNF)α以及肝脏IRS-1、IRS-2的mRNA和蛋白表达进行检测。结果与正常组比,高脂组大鼠呈现胰岛素抵抗、游离脂肪酸(FFA)和TNF-α增高;肝脏的IRS-1 mRNA和蛋白含量分别降低了28%和32%(P<0.01),IRS-2 mR-NA和蛋白含量分别降低了30%和27%(P<0.01)。结论高脂饮食导致大鼠肝脏IRS-1、IRS-2的mR-NA和蛋白含量明显降低,这可能是高脂饮食引起脂肪变肝脏胰岛素抵抗的重要分子机制。

乙型肝炎病毒基因的型特异引物结合型特异核苷酸分析

目的研究HBV感染者HBV基因型分布状况，并建立一套适合HBV病毒株分型的简便可靠的分析方法。方法通过对GenBank中全部S区基因序列（1000余条）进行比对，筛选A～H8个基因型的型特异核苷酸。采用型特异引物PCR法分型，对238例慢性乙型肝炎患者所感染病毒中未能分型的病毒株再进行S区基因巢式PCR扩增、测序筛选出其特异性核苷酸从而判定其基因型。结果238株HBV均得到分型。其中B型HBV感染者159例（男120例、女39例）；C型69例（男52例、女17例）；B＋C混合型6例（男4例、女2例），B＋D混合型4例（男3例、女1例）。B型、C型、B＋C和B＋D混合型检出率分别为66．8％、28．9％、2．5％和1．6％。未检出A、E、F、G、H基因型。结论HBV感染以B、C基因型为主，B基因型高于C基因型。少数患者为B＋C或B＋D混合型感染。B、C基因型分布与性别无关（x^2=0．794，P〉0．05）。

病毒RNA干扰抑制因子研究进展

RNA干扰是真核生物体内普遍存在的一种高度保守的基因转录后水平的调控方式，它通过核酸序列特异性作用来抑制靶基因的表达。生物细胞利用RNA干扰机制来防御病毒的侵染，而许多病毒也能够产生RNA干扰抑制因子来对抗这种防御反应，这些抑制因子对宿主细胞有多种效应，往往同时是病毒重要的致病因子。迄今已从动植物病毒中鉴定出了多种RNA干扰抑制因子，抑制因子的鉴定和作用机理研究已成为病毒与宿主相互关系研究中的一个热点。本文对RNA干扰在动植物抗病毒中的作用、病毒RNA干扰抑制因子的发现、作用机理、鉴定方法以及研究意义等方面的最新进展进行了综述。

聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎过程中外周血γδT细胞的变化及其临床意义

目的 观察慢性乙型肝炎（CHB）患者在聚乙二醇干扰素（Peg-IFN） α-2a治疗过程中外周血γδT细胞的变化,并分析其与临床指标及疗效的相关性. 方法 收集HBeAg阳性的CHB患者在Peg-IFNα-2a治疗不同时间点的外周全血,包括0周17例、12周20例、24周20例及48周16例,其中有11例患者在每个时间点均收集血样观察.流式细胞术检测外周血中γ δ T及其亚群细胞Vδ1T、Vδ2T、效应记忆γδT（γ δTem）、中央记忆γ δT （γ δTcm）、初始γδT （γδTnaive）与终末分化效应γ δT （γ δTeff）细胞的频率.同时检测肝功能、HBV血清病毒等标志物及HBV DNA水平.用SPSS 23.0统计软件分析比较各治疗时间点细胞比例的差异,以及细胞比例与丙氨酸氨基转移酶（ALT）、HBsAg、HBeAg或HBV DNA水平的相关性;并且分析持续随访的11例患者中,γδT及其亚群细胞比例与Peg-IFN α-2a治疗应答的相关性.结果 在Peg-IFNα-2a治疗0～ 48周期间,CHB患者外周血γδT及Vδ 2T细胞比例逐渐下降,48周时的γδT细胞和Vδ 2T细胞比例分别为6.89％（5％,8.15％）、4.61％ （2.16％,6.50％）,明显低于0周水平[12.5％（7.73％,19.00％）、6.59％ （3.86％,13.62％）],差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）;但V δ 1T、γ δ Tem、γ δTcm、γ δTnaive或γ δTeff亚群细胞的比例在各时间点的差异均无统计学意义（P值均＞ 0.05）.同时ALT、HBsAg、HBeAg或HBV DNA水平与γδT或Vδ2T细胞比例均呈显著性正相关（P值均＜0.05）.11例持续随访患者中,应答者的γ δ Tem细胞的比例在各时间点均显著低于无应答者,差异均有统计学意义（P值均＜ 0.05）,而其他γδT亚群细胞比例在两组间的差异均无统计学意义（P值均＞ 0.05）. 结论 Peg-IFN α-2a治疗CHB过程中γδT细胞比例随着HBV复制降低及肝脏炎症缓解而呈下降趋势,且具有较低效应记忆γδT细胞比例的CHB患者在Peg-IFNα-2a治疗中可能更易获得应答.

反向杂交法检测乙型肝炎病毒3种核苷（酸）类似物耐药突变

目的 建立一种同时检测HBV 3种核苷（酸）类似物耐药突变的方法.方法 以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计26条特异性寡核苷酸探针,包括I169T,V173L/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G,M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L,并固定于带正电荷的尼龙膜上.利用地高辛标记的靶DNA扩增产物与固定于膜上的特异性探针的反向杂交,检测HBV 3种核苷（酸）类似物的耐药突变.应用反向杂交法分别检测HBV野生和耐药标准株,以及40例患者血清标本,观察其检测特异性和准确性.结果 反向杂交法检测HBV野生和耐药标准株,有效地区分了1169T,V173L,L180M,A1811T,T184G,S202I,M204V,Q215S,N236T,M250V 10个耐药位点上的特异性探针.40例患者血清标本中,37例临床病例的耐药检测结果 与直接测序法一致.结论 反向杂交法可以快速,准确的检测出HBV3种核苷类似物耐药突变,有助于这3种药物耐药的诊断和个体化治疗.

40年风雨历程:中国乙型肝炎的负担和希望 ——谨以此文献给中国改革开放40周年

中国改革开放40周年来,全国各行各业发生了翻天覆地的变化。历经40年的风雨历程,慢性乙型肝炎防治领域研究硕果累累。乙型肝炎疫苗接种使乙型肝炎病毒(HBV)感染流行率大幅下降,有效的抗HBV治疗使广大乙型肝炎患者获益,逐步形成了抗HBV治疗领域"强效、低耐药和免疫调节并举"的共识。我们相信,在不远的将来,根据"预防为主,防治并举"的原则,通过新生儿普遍接种疫苗、高危人群接种疫苗,积极治疗HBV携带者和慢性乙型肝炎患者,实现肝细胞癌的"早期筛查、早期诊断、早期治疗"等措施。

microRNA相关实验技术

microRNA是一种长约19～23nt的小分子单链RNA，本身不编码蛋白质，主要存在于基因非编码区；其在生物个体发育、组织分化，以及病毒感染和肿瘤发生中都具有一定作用。文章综述了近年来microRNA寻找及其功能研究等实验方法，以此了解microRNA实验研究进展。

新生大鼠肝细胞脾内移植联合鼠肝再生增强因子治疗大鼠急性肝衰竭的疗效与免疫学机制

目的探讨新生大鼠肝细胞脾内移植联合重组鼠肝再生增强因子（rALR）治疗大鼠急性肝衰竭的疗效与免疫学机制。方法采用D-氨基半乳糖（1．2 g／kg）诱导并建立大鼠急性肝衰竭模型,36 h后随机分为6组：Ⅰ组：模型对照组;Ⅱ组：经脾脏注射等渗盐水1 ml,腹腔注射等渗盐水1 ml／d;Ⅲ组：经脾脏注射rALR 1 ml（50μg／kg）,腹腔注射rALR 1 ml（50μg·kg^-1·d^-1）;Ⅳ：经脾脏移植2×10^7同种异体新生大鼠肝细胞,腹腔注射等渗盐水1 ml／d;Ⅴ组：经脾脏移植2×10^7同种异体新生大鼠肝细胞,腹腔注射rALR 1 ml（50μg·kg^-1·d^-1）;Ⅵ组：经脾脏移植2×10^7同种异体新生大鼠肝细胞,腹腔注射环孢菌素1 ml（10 mg·kg^-1·d^-1）。观察大鼠每天存活率;术后第1、5天及2周处死大鼠以获取肝、脾组织,观察脾内移植肝细胞的组织学改变;在术前、术后第1、2、5、12天采集静脉血,采用放射免疫法测定血清IL-1β和TNFα的浓度。结果Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组大鼠存活时间差异无统计学意义,Ⅳ组有部分大鼠长期存活,2周存活率为33％,Ⅴ组大鼠2周存活率显著高于Ⅳ组,而与Ⅵ组大鼠2周存活率比较差异无统计学意义。Ⅳ、Ⅵ组脾内移植的肝细胞可存活5～7 d,Ⅴ组脾内移植肝细胞可存活至2周以上。术后第1天,Ⅳ组血清IL-1β水平显著高于Ⅴ组和Ⅵ组（P〈0．05）;术后第5天,Ⅳ组血清IL-1β水平仅与Ⅵ组差异有统计学意义（P〈0．05）。术后第1天,TNFα的浓度在Ⅱ组显著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组（P〈0．05）。结论新生大鼠肝细胞脾内移植与rALR联合治疗大鼠急性肝衰竭有一定疗效,可提高D-氨基半乳糖诱导肝衰竭大鼠的存活率;移植肝细胞在脾脏可存活2周以上,其机制可能与促进肝细胞再生、预防移植肝细胞凋亡及轻微抑制细胞免疫有关。

HepG2细胞中HCV NS5A蛋白对HCV IRES启动蛋白翻译的影响

目的探讨HepG2细胞中HCV非结构蛋白5A（NS5A）对HCV IRES启动蛋白翻译的影响，以了解HCV的复制调控机制。方法将构建的表达双荧光素酶的双顺反子载体pCMV-Rluc-IRES-Fluc和含HCV NS5A基因的表达质粒pcDNA-NS5A共转染HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，细胞免疫荧光技术检测HCV-NS5A蛋白的表达，RT-PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平，并与相应对照做比较，以观察HCV NS5A对HCV IRES介导虫荧光素酶翻译水平的影响。结果转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显高于转染pCDNA3．I-3flag的对照组，并存在剂量依赖关系；而RT-PCR虫荧光素酶基因mRNA水平在两组间差异无统计学意义。转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞质中可见HCV NS5A蛋白的表达。结论HCV NS5A蛋白对HCV IRES介导虫荧光素酶的翻译有正调节作用，并存在剂量依赖关系．