留学生病理学全英文教学实践与思考

为了提高病理学全英文教学质量,该文探讨了留学生病理学全英文教学中存在的管理体制、教师培养、教材选择、教学内容和管理等问题,从教学实践中探索解决这些问题的方法和提高留学生病理学学习效果的各种途径。

RNA干扰maspin基因对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响

目的:探讨转染maspin特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组质粒对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响。方法:设计并合成针对maspin基因的shRNA,并将其与真核表达载体pGenesil-1.1连接,构建重组质粒pGenesil-maspin。应用RT-PCR和Western印迹法检测转染重组质粒后MKN-28细胞中maspin、bcl-2和bax mRNA及蛋白的表达变化,应用FCM法检测转染重组质粒对MKN-28细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:成功构建maspin特异性shRNA重组质粒pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2及pGenesil-HK(阴性对照);pGenesil-maspin成功转染后可明显下调胃癌细胞MKN-28中maspin和bax mRNA及蛋白的表达水平(P<0.01),并上调bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01);重组质粒转染后,MKN-28细胞的细胞周期呈现G0/G1期细胞减少(P<0.01),细胞凋亡率下降(P<0.01)。结论:外源性maspin shRNA转染MKN-28细胞后能下调maspin的表达,抑制胃癌细胞的凋亡,且使细胞周期分布发生改变;其分子机制可能与上调bcl-2和下调bax的表达有关。

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响

目的探讨单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1[mono(ADP-ribosyl)transferase-1,ART1]基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附、运动和侵袭能力的影响及其机制。方法以携带ART1-shRNA的慢病毒感染小鼠结肠癌CT26细胞。将细胞分为实验组(感染ART1-shRNA慢病毒的CT26细胞),NC-shRNA对照组[感染阴性对照慢病毒(negative-control-shRNA,NC-shRNA)CT26细胞]及未处理组(未经处理的CT26细胞);RT-PCR检测CT26细胞ART1mRNA表达变化,Western blot检测ART1、RhoA、integrinβ1蛋白表达的变化;用细胞基质黏附、运动和侵袭实验观察ART1-shRNA对CT26细胞基质黏附、运动和侵袭能力的影响。结果获得稳定沉默ART1基因的CT26细胞株;RT-PCR和Western blot结果均显示,实验组ART1mRNA和ART1蛋白表达显著低于对照组(P<0.01);Western blot结果显示实验组RhoA、integrinβ1表达均显著低于对照组(P<0.01);实验组细胞黏附、运动、侵袭抑制率分别为70.72%,52.20%和60.00%。结论单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1(ART1)基因沉默可降低CT26细胞的黏附、运动、侵袭能力,该作用可能与ART1沉默后下调RhoA和integrinβ1活性有关。

大肠腺癌中p27^(kip1)、skp2和p53基因的表达及意义

目的:检测大肠腺癌组织中p27kip1、skp2、p53基因的表达情况,并分析与临床病理参数之间的关系,探讨其与大肠癌发生、发展的关系。方法:应用RT-PCR技术检测60例大肠腺癌、20例正常大肠粘膜组织中p27kip1、skp2、p53mRNA的表达水平,免疫组化SP法检测60例大肠腺癌、20例大肠腺瘤、20例正常大肠粘膜组织中p27kip1、skp2、p53蛋白的表达情况。结果:大肠腺癌组织中p27kip1、skp2、p53mRNA的表达水平分别为0.540±0.155,0.597±0.125,0.302±0.127均与正常大肠粘膜组织有差异(P<0.01)。60例腺癌中p27kip1、skp2、p53的阳性表达与它们在腺瘤和正常粘膜组织中的阳性表达有显著差异(P<0.001)。p53的表达与大肠癌浸润、淋巴转移及Dukes’分期有相关性(P<0.05);p27kip1和skp2的表达与肿瘤细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度、Dukes’分期的进展及淋巴结转移有相关性(P<0.05)。p27kip1表达与skp2表达呈负相关(r=-0.714,P<0.001),p53表达与p27kip1表达呈负相关(r=-0.653,P<0.001),而与skp2表达呈正相关(r=0.617,P<0.001)。结论:在大肠癌恶变进程中,p27kip1、skp2和p53表达发生相应变化,它们均可能参与了大肠癌发生、发展的过程,3种基因的联合检测可为临床判断大肠腺癌的恶性生物学行为提供重要参考。

shRNA maspin/pGenesil-1.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin基因shRNA真核表达载体,为进一步研究maspin基因在胃癌细胞株MKN-28生长、浸润、转移中的作用奠定基础.方法:设计合成针对maspin基因的shRNA与表达绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1质粒连接,构建的重组质粒分别命名为阳性质粒maspin/pGenesil和阴性质粒YX/pGenesil.分别用RT-PCR和Western blot检测转染重组质粒前后胃癌细胞株MKN-28 maspin的表达变化.结果:通过凝胶电泳和DNA测序分析,成功构建针对maspin特异性shRNA真核表达质粒maspin/pGenesil及YX/pGenesil.RT-PCR与Western blot检测发现转染成功后maspin/pGenesil组比YX/pGenesil组maspin mRNA的表达显著下降(0.127±0.02 vs 0.510±0.01,P<0.05);maspin/pGenesil组比YX/pGenesil组m a s p i n蛋白表达也显著下降(0.24±0.10 vs0.65±0.09,P<0.05).结论:成功构建了重组质粒maspin/pGenesil,经转染能有效抑制人胃癌细胞株MKN-28maspin基因的表达.

高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ在不同分化胃癌细胞和组织中的差异表达及意义

目的:分析高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(GMⅡ)在不同分化人胃癌细胞系和胃癌组织中的差异表达,以探讨GMⅡ在胃癌发生发展中的作用。方法:收集38例胃腺癌及30例癌旁正常胃黏膜组织,体外培养3株不同分化胃癌细胞系(高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化BGC-823)和永生化正常胃黏膜上皮细胞系(GES-1),分别应用RT-PCR、免疫组化和Western Blotting检测GMⅡmRNA和蛋白的表达。结果:GMⅡ阳性表达定位于胞浆,其在正常胃粘膜组织及高、中、低分化胃癌组织中的阳性表达率分别为53%(16/30)、63%(5/8)、83%(15/18)和100%(12/12),各组间差异显著(P<0.05)。细胞爬片显示GMⅡ在正常胃黏膜上皮细胞系和高、中、低分化胃癌细胞系中的表达逐渐增强。与正常胃黏膜上皮细胞系GES-1相比,3种胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、BGC-823中GMⅡmRNA及蛋白表达水平显著增加(P<0.05),且GMⅡ在低分化胃癌细胞系BGC-823中表达最高,而在高分化胃癌细胞系MKN-28中表达最低。与正常胃黏膜组织相比,高、中、低分化胃癌组织中GMⅡmRNA及蛋白表达水平亦显著增加(P<0.05),且GMⅡ表达水平在高分化胃癌组织中最低,而在低分化胃癌组织中最高。结论:GMⅡ参与了胃癌的发生和发展,其表达水平与胃癌低分化程度更密切相关。

高尔基体基质蛋白130、14-3-3ζ和整合素β3在卵巢上皮恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义

目的:探讨高尔基体基质蛋白130(Golgi matrix protein 130,GM130)、14-3-3ζ和整合素β3在卵巢上皮恶性肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学法检测49例卵巢上皮恶性肿瘤、30例卵巢上皮良性肿瘤和23例正常卵巢上皮组织中GM130、14-3-3ζ和整合素β3的表达,RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测卵巢上皮恶性肿瘤、卵巢上皮良性肿瘤和正常卵巢上皮组织中GM130、14-3-3ζ和整合素β3 mRNA及蛋白的表达。结果:GM130、14-3-3ζ和整合素β3在卵巢上皮恶性肿瘤组织中的阳性表达率明显高于卵巢上皮良性肿瘤和正常卵巢上皮组织,差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢上皮恶性肿瘤组织中GM130与14-3-3ζ的表达、14-3-3ζ与整合素β3的表达和GM130与整合素β3的表达均呈正相关(r=0.517,P<0.05;r=0.415,P<0.05;r=0.384,P<0.05)。GM130、14-3-3ζ和整合素β3的表达与卵巢上皮恶性肿瘤患者的临床分期和组织分化程度有关(P<0.05),与年龄、肿瘤大小和病理类型无关(P>0.05)。卵巢上皮恶性肿瘤组织中GM130、14-3-3ζ和整合素β3 mRNA及蛋白的表达水平明显高于卵巢上皮良性肿瘤和正常卵巢上皮组织(P<0.05)。结论:GM130、14-3-3ζ和整合素β3在卵巢上皮恶性肿瘤中的高表达可能在其恶性进程中发挥重要作用,GM130有望成为判断卵巢癌患者预后的指标及治疗靶点。

高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ、E-cadherin和α-catenin在卵巢上皮肿瘤组织和不同转移能力的卵巢癌细胞中的表达

目的:检测高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)、E-cadherin和α-catenin在不同卵巢上皮肿瘤组织和不同转移能力的卵巢癌细胞中的表达。方法:运用免疫组织化学法检测46例卵巢上皮恶性肿瘤(其中有大网膜或淋巴结转移者27例)、15例卵巢上皮交界性肿瘤及12例卵巢上皮良性肿瘤组织中GMⅡ、E-cadherin和α-catenin的表达情况。体外培养卵巢癌A2780、SKOV-3和HO-8910细胞,分别应用RT-PCR、免疫荧光和蛋白质印迹法检测GMⅡ、E-cadherin和α-catenin mRNA和蛋白的表达情况。结果:在卵巢上皮恶性肿瘤中GMⅡ的阳性表达率(87%)和E-cadherin、α-catenin的异常表达率(80%和72%)明显高于卵巢上皮交界性肿瘤(60%、20%和40%)和卵巢上皮良性肿瘤(42%、0%和17%),且有转移患者肿瘤组织中的阳性表达率和异常表达率明显高于无转移者(P<0.05)。A2780、SKOV-3和HO-8910细胞中GMⅡ荧光表达强度逐渐增强,E-cadherin和α-catenin荧光表达强度逐渐减弱。在A2780、SKOV-3、HO-8910中,GMⅡmRNA和蛋白表达水平逐渐增加,而E-cadherin和α-catenin mRNA及蛋白表达水平则逐渐减弱,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:GMⅡ、E-cadherin和α-catenin可能在卵巢癌的恶性进展中发挥重要作用,GMⅡ有望成为卵巢癌预后的标志和治疗靶点。

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及作用机制的研究

目的:通过沉默精氨酸特异性单-ADP-核糖基化作用转移酶-1(arginine-specic mono-ADP-ribosytransferase-1,ART1)基因的表达,探讨其对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能的作用机制。方法:采用慢病毒转染系统将特异性针对ART1基因的ART1-shRNA转入结肠癌CT26细胞中,在荧光显微镜下观察转染效率;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法鉴定ART1基因沉默的效果;采用Transwell小室侵袭实验和黏附实验观察ART1基因沉默对CT26细胞侵袭及黏附能力的影响;明胶酶谱法测定ART1基因沉默对CT26细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metall oproteinase-2,MMP-2)及MMP-9蛋白活性的影响;蛋白质印迹法检测对ART1、RhoA(Ras homolog gene family,member A)、ROCK1(Rho-associated coiled-coil contanining kinase 1)、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。结果:成功获得了ART1基因沉默的稳定细胞株;ART1-shRNA转染组CT26细胞的侵袭及黏附抑制率分别为39.63%和40.70%,与空白对照组相比,ART1基因沉默后CT26细胞侵袭和黏附能力降低(P<0.05);MMP-2和MMP-9蛋白的活性降低,RhoA、ROCK1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达量均被下调(P<0.05)。结论:ART1基因沉默可降低CT26细胞的侵袭和黏附能力,可能与ART1基因沉默后下调RhoA、ROCK1、MMP-2和MMP-9的表达以及MMP-2和MMP-9蛋白的活性有关,提示ART1基因在结肠癌侵袭和转移中发挥重要的作用。

解偶联蛋白-2在软脂酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗中的作用及其与核转录因子-κB的关系

目的探讨解偶联蛋白-2(Uncoupling protein-2,UCP-2)在软脂酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗(Insulin-resistance,IR)中的作用及其与核转录因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)的关系。方法将HepG2细胞分为正常对照组、软脂酸组(加0.25mmol/L软脂酸)、高胰岛素组(加100nmol/L胰岛素)、软脂酸+京尼平组(加0.25mmol/L软脂酸和10μmol/L京尼平),培养24h后,再用100nmol/L胰岛素刺激,分别于12h后测定培养液中葡萄糖、MDA、SOD、ALT、AST、GGT、TG的浓度;油红O染色法观察细胞的脂变情况;流式细胞术检测线粒体膜电位改变;30min后采用半定量RT-PCR及Westernblot法检测细胞IRS-2、UCP-2及NF-κB的表达水平。结果胰岛素作用12h后,细胞培养液中葡萄糖含量软脂酸组与高胰岛素组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。培养液中葡萄糖含量、ALT、AST、MDA、GGT、TG的含量及UCP-2和NF-κB的表达水平,软脂酸组均较正常对照组和软脂酸+京尼平组显著升高(P<0.05),软脂酸+京尼平组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。线粒体膜电位、SOD和IRS-2的水平,软脂酸组显著低于正常对照组和软脂酸+京尼平组(P<0.05),软脂酸+京尼平组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 UCP-2在软脂酸诱导的肝脏胰岛素抵抗中起着重要作用,其机制可能与NF-κB有关。

p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制

目的探讨高尔基体囊泡转运蛋白(Golgi-vesicular transport protein)p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响及其机制。方法采用脂质体法将质粒pGPU6/GFP/Neo/p115(p115 shRNA)和阴性对照质粒(shNC)分别转染至BGC-823细胞中,并设空白对照组。转染后48 h,采用RT-PCR、Westernblot和细胞免疫荧光法检测各组细胞中p115基因及蛋白表达的变化,及其对巨噬细胞游走抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metallopro-teinase-2,MMP-2)、MMP-9基因和蛋白表达的调节;细胞划痕及Transwell小室试验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果p115 shRNA组细胞中p115、MIF、MMP-2、MMP-9在基因和蛋白水平的表达均较shNC组和空白对照组明显下降(P<0.01);p115shRNA组细胞的划痕愈合能力明显低于两个对照组(P<0.01);p115 shRNA组的穿膜细胞数明显低于两个对照组(P<0.01)。结论在BGC-823细胞中,抑制P115的表达后,可能通过下调MIF、MMP-2、MMP-9的表达,抑制肿瘤细胞的侵袭运动。

人端粒酶逆转录酶基因沉默对卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及其机制

目的检测人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因沉默对卵巢癌细胞株A2780生长抑制和凋亡的影响,并探讨其与p53、p21基因表达激活的相关性。方法设计合成针对hTERT基因的shRNA干扰质粒,与可表达荧光蛋白的pGenesil-1.1质粒连接,构建重组质粒pG1、pG2和阴性质粒pGCR,转染A2780细胞,采用荧光定量RT-PCR检测转染细胞hTERT基因mRNA的表达,Western blot检测细胞hTERT、P53和P21蛋白的表达,TRAP法检测细胞的端粒酶活性,CCK-8法检测细胞的生长,流式细胞术分析细胞周期,AnnexinⅤ-PE/7AAD双染和TUNEL法检测细胞凋亡。结果酶切及测序结果证实重组质粒pG1、pG2和pGCR构建正确,质粒pG1和pG2转染可明显下调A2780细胞hTERT的表达水平和端粒酶活性,而上调细胞P53和P21蛋白的表达水平;沉默hTERT基因表达能够引起A2780细胞的生长抑制和G0-G1期细胞比例明显下降,并出现明显的细胞凋亡。结论针对hTERT基因的shRNA干扰质粒在体外能有效和特异地沉默卵巢癌A2780细胞hTERT基因的表达,降低端粒酶活性,并引起细胞的生长抑制和凋亡,其机制可能与抑癌基因p53及p21上调有关。

沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨RNA干扰沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的影响。方法:为沉默GMⅡ基因,构建了4个分别针对不同靶位点的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照质粒表达载体。应用LipofectAMINE2000将质粒转染入BGC-823细胞。分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后GMⅡmRNA和蛋白表达的变化,选出沉默效果最佳的质粒。应用Transwell侵袭实验和划痕损伤实验分别检测GMⅡ基因沉默对人胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响。结果:质粒载体pGPU6/GFP/Neo-1303沉默GMⅡ基因的效果最好。转染pGPU6/GFP/Neo-1303组穿透小室基质的细胞数明显少于空白对照组和转染阴性对照组(P<0.05)。无血清培养液培养24h后,转染pGPU6/GFP/Neo-1303组细胞的迁移能力较空白对照组和转染阴性对照组明显降低(P<0.05)。结论:RNA干扰技术可沉默人胃癌BGC-823细胞中GMⅡmRNA和蛋白的表达,从而抑制BGC-823细胞的侵袭和迁移能力。GMⅡ可能成为胃癌治疗的新靶点之一。

鼠肝高尔基体双向凝胶电泳的建立

目的分离纯化鼠肝高尔基体,初步建立一套相对完善、分辨率和重复性均较高的高尔基体双向凝胶电泳技术。方法应用蔗糖密度梯度超离心法分离纯化高尔基体,通过电镜观察和标志酶分析鉴定其形态及纯度,双向凝胶电泳分离高尔基体蛋白质,用PDQuest8.0软件分析电泳图谱。结果电镜观察显示大部分为高尔基体,纯化高尔基体标志酶TPP酶比活力提高了120倍,得到了分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱。结论已成功建立了鼠肝高尔基体双向凝胶电泳技术。