环状RNA hsa_circ_0050900在乳腺癌中的表达及其对细胞生物学行为影响的机制研究

背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为特殊的非编码RNA,一般在体内低表达,且不易被RNA酶降解,结构与表达稳定。随着测序技术的进步,目前发现多种肿瘤的发生、发展与circRNA有关。但未见乳腺癌的发生、发展与hsa_circ_0050900的异常表达相关的报道。探究乳腺癌组织中hsa_circ_0050900的表达以及其影响乳腺癌细胞生物学行为的机制。方法:选取在重庆医科大学附属第一医院经手术切除的4例女性乳腺癌组织及对应的癌旁组织,采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)进行测序分析,并运用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)验证乳腺癌中hsa_circ_0050900的表达,其中包括30例乳腺癌组织及其癌旁组织(在重庆医科大学附属第一医院经手术切除),正常人乳腺上皮细胞系即对照组细胞MCF-10A以及两种乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3。通过RTFQ-PCR验证乳腺癌细胞中hsa_circ_0050900被敲低后的表达水平;分别运用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)实验和EdU实验、细胞划痕实验、transwell实验验证细胞的增殖、迁移功能;细胞凋亡的检测采用TUNEL一步法;Hoechst 33342实验通过对细胞核染色确定细胞的状态以检测细胞凋亡;细胞周期蛋白D2(cyclin D2,CCND2)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)的表达采用蛋白质印迹法(Western blot)检测。结果:根据测序结果,挑选出在乳腺癌和细胞中明显高表达的circRNA hsa_circ_0050900;构建的si-circ质粒可显著降低hsa_circ_0050900在乳腺癌细胞中的表达,转染si-circ的细胞增殖能力降低,并促进细胞凋亡,且降低细胞周期相关蛋白CCND2、CDK4的表达。结论:circRNA hsa_circ_0050900在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,敲低hsa_circ_0050900对细胞增殖、迁移能力、细胞凋亡及细胞周期有调控作用。

特异性ILK-siRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭和迁移的影响

目的设计合成有效的ILK-siRNA,并检测其对EJ细胞侵袭和迁移的影响。方法构建针对ILK基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体pGenSil-1 siRNA1、pGensil-1 siRNA2和1个阴性对照载体pGenSil-1 siRNA3。稳定转染膀胱癌EJ细胞后,通过RT-PCR检测EJ细胞中ILK mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫荧光检测ILK蛋白水平的表达;观察EJ细胞形态变化;检测EJ细胞迁移、黏附和侵袭能力及基质金属蛋白酶的变化。结果重组质粒构建成功。干扰组细胞ILK mRNA及蛋白的表达分别较3个对照组(未转染组、转空质粒组和转阴性对照质粒组)比较,呈显著性下降(P<0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染干扰质粒的2个实验组细胞的黏附能力相对于对照组分别增加87%和76%,黏附能力显著升高,迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05);与3个对照组比较,转染pGenSil-1 siRNA1与pGensil-1 siRNA2质粒到EJ细胞后,MMP-2及MMP-9的表达水平明显降低(P<0.05)。结论成功构建的干扰质粒能抑制ILK基因及蛋白水平的表达,显著抑制细胞的生长、侵袭及迁移能力。

特异性ILK siRNA对膀胱癌EJ细胞EMT及移植瘤生长的影响

目的研究整合素连接激酶(ILK)特异siRNA沉默ILK基因对膀胱癌EJ细胞上皮间质转化(EMT)及移植瘤生长的影响。方法用特异性ILK siRNA表达载体p Gensil-1siRNA1质粒和对照质粒p Gensil-1siRNA3稳定转染EJ细胞,实验分为EJ siRNA组、EJ vector组和EJ细胞组;激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架;Western blot检测p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达;细胞免疫荧光检测p-AKT、p-GSK-3β的表达;用免疫荧光检测整合素连接激酶和核糖核酸酶抑制因子在EJ细胞中的共定位;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;建立裸鼠移植瘤模型,肿瘤和肺组织切片HE染色,免疫组化检测瘤组织中ILK、RI、NM23-H1和E-cadherin蛋白的表达;免疫荧光检测p-AKT、p-GSK-3β和CD31蛋白的表达。结果 EJ siRNA组细胞运动能力减弱;EJ siRNA组p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达明显降低(P<0.05);MTT法结果提示实验组细胞增殖明显受到抑制;下调ILK通过阻滞G0/G1期抑制细胞增殖;下调ILK抑制膀胱癌EJ细胞移植瘤生长转移。结论特异性ILK siRNA可以改变EJ细胞特性,抑制EMT的发生,引起增殖侵袭能力下降。

上调RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响

目的研究核糖核酸酶抑制因子基因表达对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT及转移的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI,稳定转染B16-F10细胞。RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测RI的表达;HE染色及相差显微镜观察细胞形态;FITC标记的鬼笔环肽染色,激光共聚焦观察细胞骨架;黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测EMT及转移相关蛋白的表达;分别将各组B16-F10细胞眼眶静脉注射到c57/BL小鼠,建立肺转移动物模型,注射3周后处死小鼠。取肺称重,在解剖镜下计数肺转移结节数;肺组织切片HE染色观察肿瘤细胞转移;免疫组化检测肺转移瘤组织中转移及EMT相关蛋白的表达。结果 RI表达上调后,细胞由间质型向上皮型转换,细胞骨架重排;B16-F10-RI细胞组黏附、迁移和侵袭能力下降;与对照组相比,B16-F10-RI细胞中MMP2、MMP9、snail、slug、vimentin、twist和N-cadherin的表达明显降低,而E-cadherin,nm23-H1蛋白的表达明显增加(P<0.01或P<0.01)。实验组与对照组比小鼠肺的转移结节明显减少,同时EMT及转移相关蛋白在瘤组织中表达与体外细胞一致。结论上调核糖核酸酶抑制因子能够显著抑制B16-F10细胞EMT及侵袭、转移,RI可望作为治疗黑色素瘤的靶蛋白。

抑制miR-130b-3p通过上调PTEN和灭活PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路抑制膀胱癌细胞增殖

miR-130家族在癌的进展中发挥作用;然而,其家族成员在膀胱癌中的作用尚罕见报告。本研究证明,抑制miR-130家族成员miR-130b-3p表达促进PTEN表达,诱导细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖。首先,我们采用微阵列对来自膀胱癌患者的4对膀胱癌和癌旁组织进行了miRNA和mRNA组学分析,发现miR-130b-3p和miR-106b-3p在膀胱癌组织高表达,而miR-99a-3p、miR-199a-5p和miR-145-3p低表达。RT-q PCR检测30对膀胱癌组织5种miRNA的表达与微阵列中的表达状况一致。此外,我们在mRNA组学分析中还发现,miR-130b-3p在膀胱癌组织的高表达与PTEN表达呈负相关。为此,在后续研究中集中探索了miR-130b-3p在膀胱癌中的作用及其作用机制。生物信息学及荧光素酶报告结果证明,miR-130b-3p可直接结合PTEN的3'-UTR,靶向抑制PTEN的表达。转染结合CCK-8、EDU、流式分析、划痕及Transwell小室实验显示,转染miR-130b-3p模拟物可明显促进膀胱癌T24细胞的增殖、迁移及侵袭能力;相反,转染miR-130b-3p抑制物可明显诱导T24细胞凋亡。鬼笔环肽染色揭示,转染miR-130b-3p模拟物可促进细胞骨架形成,而转染miR-130b-3p抑制物抑制细胞骨架形成。Western印迹证明,转染miR-130b-3p可下调PTEN在T24细胞的表达,上调p-PI3K、p-AKT、p-FAK和整合素β1的表达;而转染miR-130b-3p抑制物上调PTEN的表达,下调p-PI3K、p-AKT、p-FAK和整合素β1的表达。上述结果提示,miR-130b-3p通过抑制PTEN表达,激活PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路,在膀胱癌中发挥癌基因样作用;相反,抑制miR-130b-3p可上调PTEN表达,抑制PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路的激活,诱导凋亡,抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。我们的结果还提示,miR-130b-3p作为可能的临床标志物,对膀胱癌的诊断、靶向治疗具有潜在的应用价值。

环状RNA hsacirc0005320在三阴性乳腺癌中的表达及其对细胞增殖的影响

背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为新近发现的具有重要调节潜能的非编码RNA,与多种肿瘤的发生、发展密切相关,但在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中罕见报道。探讨hsacirc0005320在TNBC中的表达变化及其对细胞增殖的影响。方法:通过RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)分析4对于重庆医科大学附属第一医院行手术切除的TNBC组织和癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerasechainreaction,RTFQ-PCR)验证20对TNBC组织和癌旁组织以及正常人乳腺上皮细胞MCF-10A和TNBC细胞MDA-MB-231、BT-549中hsacirc0005320的表达,并通过荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization,FISH)实验进一步检测其在TNBC中的表达。采用RTFQ-PCR检测沉默hsacirc0005320后TNBC细胞中hsacirc0005320的表达;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和EdU实验检测细胞增殖;采用流式细胞术、Hoechst 33342、Tunel实验检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测LIF-STAT3通路相关蛋白的表达情况。结果:hsacirc0005320在TNBC组织和细胞中显著高表达;在TNBC细胞中沉默hsacirc0005320后其表达量显著降低,细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡,导致细胞周期阻滞在G1期,且LIF、P-STAT3蛋白表达水平明显下降。结论:hsacirc0005320在TNBC中高表达,沉默hsacirc0005320可显著抑制TNBC细胞的增殖,诱导细胞凋亡。

LncRNARP11-79H23.3在膀胱癌细胞中的作用及其发生、发展的研究

背景与目的:虽然许多长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)的异常表达与膀胱癌的发生有密切关系,但对于lnc RNA RP11-79H23.3暂未见报道。该研究旨在探讨lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌EJ细胞中的作用及其发生、发展的机制。方法:采用微阵列方法对4对膀胱癌患者的癌和癌旁组织进行组学分析,随后用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测膀胱癌组织、癌旁组织及正常人膀胱上皮细胞sv-HUC-1、膀胱癌EJ细胞中RP11-79H23.3的表达。通过转染p IRES2-RP11-79H23.3上调该基因后,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Ed U的方法检测EJ细胞的增殖活性,通过Transwell小室和平板划痕实验分别检测EJ细胞的侵袭和迁移能力,应用流式细胞术、Hoechst33342及Tunel检测细胞凋亡,应用细胞免疫荧光检测PTEN在膀胱癌细胞中的定位,采用鬼笔环肽染色观察细胞骨架形成,应用蛋白[质]印迹法(Western blot)分析过表达RP11-79H23.3后EJ细胞中PI3K/AKT信号通路中相关蛋白的表达情况。结果:Lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌组织和膀胱癌EJ细胞中表达下调(P<0.001,P<0.01),p IRES2-RP11-79H23.3转染EJ细胞结果显示,RP11-79H23.3的表达量较转染前显著增加(P<0.01)。上调RP11-79H23.3的表达可诱导膀胱癌EJ细胞的凋亡,相反,转染p IRES2-EGFP可促进EJ细胞的增殖、侵袭和迁移能力,同时,Western blot结果显示,转染p IRES2-RP11-79H23.3后可上调PTEN在EJ细胞中的表达,下调p-PI3K、p-AKT及p-Gsk3β蛋白的表达(P<0.05)。结论:Lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌组织和膀胱癌EJ细胞中低表达(P<0.001,P<0.01),并且过表达RP11-79H23.3会降低膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。提示lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌恶性肿瘤中发挥重要的作用,可能会成为治疗膀胱癌的药物作用靶点。

过表达核糖核酸酶抑制因子通过调节ILK/PI3K/AKT信号途径抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞体内外生长

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是胞浆内的一种酸性蛋白质.已有研究证明,RI与核糖核酸酶A(RNase A)和血管生成素(angiogenin,ANG)结合可抑制其活性.本室前期实验证实,RI可有效抑制某些肿瘤的生长和转移.然而,RI抑制肿瘤的分子机制尚不清楚.本研究探讨RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞生长和凋亡的影响及其机制.MTT法结合流式细胞术分析结果证明,RI基因稳定转染导致B16-F10黑色素瘤细胞S期阻滞,抑制B16-F10黑色素瘤细胞增殖.Annexin V/PI结合流式细胞术结果显示,RI过表达引起细胞凋亡.与此相一致,蛋白质印迹分析显示,过表达RI引起抗凋亡分子Bcl-2表达下调,而Bax上调,同时伴有Pro-casepase 3激活.C57BL/6小鼠移植成瘤实验显示,与对照相比,转染RI的B16-F10细胞形成的肿瘤重量显著减少,同时伴有肿瘤组织微血管密度降低.提示RI过表达能抑制微血管生成.此外,体内外组织/细胞免疫化学和蛋白质印迹结果揭示,过表达RI可显著抑制整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)下游靶分子Akt和GSK-3β的磷酸化,并降低β-联蛋白的表达.研究结果证明,过表达RI可通过抑制ILK/PI3K/AKT信号通路,促进细胞凋亡,引起S期阻滞,并抑制血管生成,从而显著抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞在体内、外的生长.上述结果提示,RI可能是治疗黑色素瘤的有效分子靶点.

HBc蛋白与NIRF蛋白细胞外相互作用鉴定

构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3*FLAG-CMV-10中,构建出pGST-HBc及pFLAG-NIRF。pFLAG-NIRF转染HEK293,培养48 h,收获前10 h加入MG132抑制蛋白酶体,收获细胞,经NP40裂解后离心收集上清pGST-HBc转化BL21(DE3)细菌,优化培养条件使GST-HBc在上清中大量表达,然后用GST4Bgel亲合纯化该蛋白,结合有GST-HBc蛋白与含FLAG-NIRF的细胞上清孵育后,离心收集GST 4Bgel,经洗脱液洗脱后蛋白电泳,western blotting分析。构建了pGST-HBc及pFLAG-NIRF,在上清中成功表达GST-HBc并纯化该蛋白,在细胞中成功表达FLAG-NIRF,GST pull down结果显示两者存在体外相互结合。HBc与NIRF能够在细胞外发生相互结合。

ANG及其突变体对膀胱癌血管生成的影响及分子机制研究

目的探讨血管生成素(ANG)及其突变体对膀胱癌血管生成的影响及作用机制。方法构建ANG突变质粒(BIU87-ANG^(H13R)、BIU87-ANG^(H114R)),与BIU87-ANG组成实验组,BIU87-C1为对照组。采用pEGFP-C1-ANG^(H13R)、pEGFP-C1-ANG^(H114R)、pEGFP-C1-ANG及pEGFP-C1稳定转染膀胱癌BIU87细胞,构建稳定转染细胞系;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中的相关靶蛋白;采用鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)血管生成实验和小管形成实验检测ANG及其突变体对膀胱癌血管生成的影响;采用双荧光素酶报告基因系统检测过表达核糖核酸酶抑制因子时核糖体RNA(rRNA)的转录活性。结果稳定转染ANG及其突变体的膀胱癌BIU87细胞系构建成功;当ANG及突变体过表达时,磷酸化PI3K、磷酸化GSK3(α/β)、磷酸化AKT、磷酸化mTOR、磷酸化PTEN水平增加;CAM血管生成实验和小管形成实验结果表明,实验组(BIU87-ANG^(H13R)、BIU87-ANG^(H114R)、BIU87-ANG)CAM血管生成及小管形成均明显多于对照组(BIU87-C1),差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因结果表明过表达核糖核酸酶抑制因子抑制rRNA的转录活性。结论ANG及其突变体可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进膀胱癌肿瘤血管生成。

NIRF对P53蛋白泛素化作用的研究

HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF体外泛素化反应系统中,检测NIRF对P53的体外泛素化.结果表明:NIRF能与P53相互作用,NIRF不仅能与P53特异性结合,而且还会将P53泛素化,这种相互作用在细胞内和细胞外均能发生.推测NIRF可能是P53的一个新的负调节蛋白.

高等医学院校生物学科主干课程整合与教学体系重构初探

课程整合及相应的教学体系重构是当前高等医学教育改革的核心与热点。医学教育中,生物学学科主干课程的整合很有必要,但目前尚无成熟的模式。作者尝试将《生物化学》、《分子生物学》、《细胞生物学》和《医学遗传学》四门生物学主干课程进行整合,对原有教学内容进行优化、精简和融合,形成了一门新的整合课程。在课程教学中,"以学生为中心",采用基于案例和问题的小组讨论式教学;采取形成性评价与总结性评价相结合的方法进行课程考核和成绩评定;跨科室组建教学团队,实行多学科联组教学。这些尝试为高等医学院校生物学相关课程的整合提供了有益的借鉴和经验。

RI与ANG相互作用对BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤生长转移及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的探讨核糖核酸酶抑制因子(RI)与血管生成素(ANG)相互作用对BALB/C裸鼠人膀胱癌(cloladder cancer)移植瘤的生长转移及对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。方法构建BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤模型,通过HE染色、免疫组织化学染色、免疫荧光和免疫印迹法检测相关通路蛋白的表达情况。根据不同的组合分为:BIU-87+ANG,BIU-87+RI,BIU-87+ANG+RI和BIU-87+空质粒组,每组接种6只BALB/C裸鼠。结果接种后一周左右皮下有实体瘤生成,30天后处死BALB/C裸鼠,取出肿瘤并称取其重量。实验组BIU-87+RI和BIU-87+ANG+RI组比对照组的肿瘤重量低,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺HE染色观察显示实验组肺部转移结节明显比对照组少,BIU87+ANG组中p-mTOR,p-PI3K,p-Akt和p-GSK3β表达升高,BIU87+RI组和BIU-87+ANG+RI组表达下降。结论 RI与ANG相互作用抑制BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤的生长转移,同时抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中磷酸化蛋白的水平。

BiP调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应

正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response)。内质网应激条件下,内质网腔中的分子伴侣结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合从而帮助蛋白形成正确结构;同时未折叠蛋白通过与跨膜蛋白IRE1直接结合活化其内切核糖核酸酶结构域,活化的IRE1能够剪切Xbp1的mRNA使其形成有活性的转录因子进而起始分子伴侣与未折叠蛋白反应相关蛋白的表达使细胞脱离内质网应激状态。文章克隆了IRE1的启动子用荧光素酶报告基因法检测到BiP能够上调IRE1的启动子活性。通过构建IRE1启动子一系列截短体的报告基因载体确定了IRE1启动子活性的核心区域进一步通过逆转录PCR和免疫印迹在mRNA水平和蛋白水平分别检测BiP对IRE1启动子的调控作用。结果发现在内质网应激条件下分子伴侣BiP通过上调IRE1启动子转录活性增加IRE1的表达进而提高细胞处理内质网应激时未折叠蛋白的能力为揭示内质网应激条件下BiP调控IRE1转录调控机制提供理论依据,同时为阐明ER stress各信号分子之间的作用机制奠定实验基础。

核糖核酸酶抑制因子与整合素连接激酶相互作用通过ILK/AKT/mTOR通路抑制膀胱癌体内外生长

背景与目的:蛋白质相互作用控制着细胞信号转导、跨膜转运、DNA合成及转录调控等生命过程,在生命活动中发挥重要作用。前期运用GST蛋白沉降技术与免疫共沉淀等已证明核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)与整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)在体内外直接结合。该研究旨在探讨RI与ILK相互作用对ILK/AKT/m TOR通路与膀胱癌体内外生长的影响。方法:采用免疫荧光观察RI与ILK在膀胱癌EJ细胞中的共定位。采用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)验证RI与ILK的相互作用。构建过表达RI或ILK的EJ细胞系。采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测细胞中RI、ILK及ILK/AKT/m TOR通路相关蛋白的表达。采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)与流式细胞术分析细胞增殖与细胞周期。构建膀胱癌裸鼠移植瘤模型,观察过表达RI或ILK对移植瘤生长的影响。采用免疫组织化学与免疫荧光分析瘤组织中RI、ILK及ILK/AKT/m TOR通路相关蛋白的表达。结果:EJ细胞中RI与ILK存在共定位的现象且RI与ILK存在相互作用。过表达RI抑制EJ细胞增殖并导致细胞周期阻滞于S期(P<0.05),阻碍膀胱癌移植瘤的生长(P<0.05),并抑制体内外ILK/AKT/m TOR通路的活化(P<0.05)。而过表达ILK促进细胞增殖与移植瘤的生长(P<0.05),促进体内外ILK/AKT/m TOR信号通路的激活(P<0.05)。结论:RI通过与ILK相互作用阻碍ILK/AKT/m TOR通路激活并抑制膀胱癌体内外的增殖生长。

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定(英文)

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.

血管生成素及其突变体与核糖核酸酶抑制因子蛋白的相互作用

目的研究血管生成素(ANG)突变体与核糖核酸酶抑制因子(RI)的相互作用。方法构建p CMV-3×flagANGH13R和p CMV-3×flag-ANGH114R突变体质粒;用免疫荧光标记结合共聚焦显微镜技术来确立RI与ANG突变体蛋白在BIU-87细胞内的定位;用GST融合蛋白沉降技术检测RI与ANG突变体蛋白在细胞外的相互作用;用免疫共沉淀(Co-IP)实验检测两蛋白在人膀胱癌BIU-87细胞内的相互作用。结果 p CMV-3×flag-ANGH13R和p CMV-3×flag-ANGH114R突变体质粒构建成功;RI和ANG突变体蛋白存在共定位现象;GST-RI融合蛋白诱导表达正确,RI和ANG突变体蛋白在原核反应体系中存在相互作用;RI与ANG突变体蛋白在真核细胞内存在相互作用。结论 RI和ANG突变体蛋白在原核反应体系和真核细胞中都存在相互作用,并且两突变型与RI相互作用存在一定的差异。

核糖核酸酶抑制因子与整合素连接激酶的相互作用以及对体外血管生成的影响

目的研究核糖核酸酶抑制因子(RI)与整合素连接激酶(ILK)的相互作用以及对体外血管生成的影响。方法用LV5-RNH1 homo、LV5NC、pCMV-3×flag-ILK和pCMV-3×flag分别转染EJ细胞后,筛选稳定转染细胞系,分为EJ-RI、EJ-LV5、EJ-ILK、EJ-FLAG和EJ组;构建ILK与红色荧光蛋白融合表达载体YFP-ILK,与CFP-RI质粒共转染293细胞和EJ细胞,用荧光显微镜观察RI和ILK蛋白在细胞内的共定位;构建真核表达质粒pCMV-3×flagILK,用GST蛋白沉降技术检测RI和ILK蛋白在体外的结合作用;用免疫共沉淀(Co-IP)实验检测蛋白RI和ILK在真核细胞内的结合作用;用小管形成实验探索RI和ILK的相互作用对体外血管形成的影响。结果真核表达载体YFP-ILK和pCMV-3×flag-ILK构建成功;细胞内绿色荧光蛋白融合表达的RI和红色荧光蛋白融合表达的ILK在荧光显微镜下存在共定位现象;RI和ILK蛋白在原核细胞反应体系中存在相互作用;RI和ILK蛋白在真核细胞反应体系内也存在相互作用;RI和ILK的相互作用能抑制血管生成(P<0.05)。结论 RI和ILK蛋白在原核细胞防御体系和真核细胞反应体系中均存在相互结合作用,并对体外血管生成有抑制作用。

乙型肝炎病毒C蛋白和X蛋白的修饰及其意义

乙型肝炎病毒(HBV)作为一个外来入侵的病毒可以激发人体的免疫反应,导致人体一系列与HBV感染有关的病理变化与临床表现。HBC和HBX是由HBV基因编码的两种重要蛋白。HBC对病毒基因组的复制和成熟是必不可少的,其蛋白修饰后的产物对病毒在宿主细胞内的组装、成熟和对外分泌中发挥着作用。HBX能与多种蛋白发生相互作用,在HBV的复制中起着不可或缺的作用,也影响着肝细胞癌的形成。现有的对HBC和HBX的磷酸化和泛素化过程的研究,为进一步揭示HBV的致病机制提供了依据,希望最终为乙型肝炎的临床治疗寻找一条新的途径。

人NIRF蛋白与HBV核心蛋白相互作用的初步研究

人NIRF蛋白在细胞内是否能与HBV核心蛋白发生相互结合,目前尚不清楚.构建pcDNA3-HBC质粒,采用基因共转染和共表达技术,在真核细胞内进行NIRF与HBc的免疫荧光共定位实验,并通过免疫共沉淀实验进一步验证两种蛋白是否发生相互结合.结果表明在细胞内,NIRF能与HBc发生相互结合.