炎症上调固醇调节元件结合蛋白1致C57BL/6J小鼠肝脏脂质积聚

目的:研究炎症是否通过影响核转录因子固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory binding protein1,SREBP1)而致C57BL/6J小鼠肝脏脂质的异常聚集。方法:将8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(n=6)和炎症组(n=6)组,2组均喂以高脂饮食,炎症组小鼠皮下注射酪蛋白建立慢性炎症模型,对照组注射相应量磷酸盐缓冲液,18周后处死,测定血清中炎症介质水平及肝脏中的脂质水平,油红O染色观察肝脏脂质沉积情况,实时定量PCR和Western blot检测肝脏肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein1,MCP1)及脂肪酸合成相关基因SREBP1、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase alpha,ACCα)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)的基因和蛋白水平。结果:与对照组相比,炎症组血清中的炎症因子细胞白介素-6(interleukin-6,IL-6)(t=3.866,P=0.003)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloidA,SAA)(t=15.207,P=0.000)水平以及肝脏中炎症因子MCP1(t=2.56,P=0.028)和TNF-α(t=11.169,P=0.000)的mRNA水平均显著上升,Western blot结果亦显示炎症组小鼠肝脏中TNF-α和MCP1蛋白水平高于对照组。炎症状态下,肝脏甘油三酯(triglyc-eride,TG)和游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)含量显著高于对照组[(0.21±0.07)mg/mg vs.(0.40±0.14)mg/mg,t=2.98,P=0.014;(3.80±0.58)nmol/mg vs.(5.38±1.38)nmol/mg,t=2.596,P=0.027]。油红O结果显示,炎症使脂质积聚更显著。SREBP1(t=6.161,P=0.000)及其下游与FFA和TG合成相关的基因ACCα(t=14.937,P=0.000),FAS(t=6.976,P=0.000)的mRNA水平在炎症组均显著上升,Western blot结果亦显示炎症组小鼠肝脏中ACCα、FAS的蛋白水平高于对照组。结论:炎症可能通过上调SREBP1,加重脂质在肝脏的聚集。

γ疱疹病毒68病毒感染对小鼠肝脏脂质积聚的影响

目的:观察鼠γ疱疹病毒68感染对C57BL/5J小鼠肝脏脂质积聚的影响并探讨其潜在机制。方法:采用高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠,并用腹腔注射病毒的方法感染小鼠,处理18周后,检测血清炎症因子含量和肝脏组织炎症因子的表达,对小鼠肝脏进行HE和油红O染色,并用荧光定量逆转录PCR和Western blot检测脂肪酸代谢途径中关键基因的mRNA和蛋白表达。结果:与单纯高脂饮食喂养的小鼠比较,病毒感染小鼠的血清白介素6和血清淀粉样蛋白A含量增加(t值分别为-3.285和-6.528,P值分别为0.008和0.000),肝脏肿瘤坏死因子表达水平也升高(t=-5.234,P=0.002),肝脏组织的脂肪变性程度加重,肝脏内甘油三酯和游离脂肪酸的含量明显高于对照组(t值分别为-3.440和-2.967,P值分别为0.006和0.020)。同时病毒感染促进了小鼠肝脏的固醇调节元件结合蛋白1,脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶的mRNA表达水平(t值分别为-4.659,-4.210和-4.521,P值分别为0.001、0.004和0.004)和蛋白表达。结论:腹腔注射疱疹病毒能成功感染C57BL/6J小鼠,引起小鼠全身系统性和肝脏局部的炎症反应,促进脂质在肝脏的异常积聚,这可能与炎症状态下脂肪酸合成与羧化的关键基因表达异常增加有关。

高脂饮食对C57BL/6J小鼠肝脏组织糖异生的影响

目的:研究高脂饮食对C57BL/6J小鼠肝脏组织糖异生的影响。方法:将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为普通饮食组和高脂饮食组。饲养14周后处死,收集血清和肝脏组织,ELISA和酶学方法检测血清与肝脏组织中甘油三脂(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)含量,测定血清中胰岛素水平;过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色观察肝细胞糖原颗粒;实时定量PCR和Western blot分别检测肝脏组织糖异生相关的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸激酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)的基因和蛋白表达水平;葡萄糖耐量实验评价小鼠胰岛素抵抗程度。结果:饲养14周后,高脂饮食组小鼠体质量较普通饮食组明显增加;与普通饮食组相比,高脂饮食组小鼠血清与肝脏组织中TG、FFA含量明显增加;PAS染色表明高脂饮食组肝脏糖原含量明显增多;基因和蛋白检测结果显示高脂饮食组肝脏组织中糖异生相关的基因、蛋白表达增加;同时空腹血糖及血清胰岛素明显增加;葡萄糖耐量实验异常,血糖峰值延迟。结论:高脂饮食使C57BL/6J小鼠肝脏组织PEPCK、G-6-Pase表达增加,糖异生增加,导致空腹血糖增加,葡萄糖耐量受损。

高脂饮食致C57BL/6J小鼠脂肪组织中胰岛素受体底物蛋白1异常磷酸化的分子机制

目的:通过体内实验探讨高脂饮食(high fat diet,HFD)是否通过干扰哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)/核糖体蛋白S6激酶(p70 S6 kinase,S6K)信号通路致C57BL/6J小鼠脂肪组织中胰岛素受体底物蛋白1(insulin receptor substrate protein1,IRS1)异常磷酸化。方法:8周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为普通饮食(chow diet,CD)组、HFD组、HFD+溶媒(vehicle,Veh)组(HFD+Veh)及HFD+雷帕霉素(rapamycin,rapa)组(HFD+rapa),处理14周。ELISA、酶法分别测定血清及组织游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)、甘油三酯(triglyceride,TG)含量。葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验用于分析机体胰岛素敏感性,判断是否存在胰岛素抵抗。Western blot技术检测胰岛素信号通路及mTOR/S6K信号通路相关蛋白表达水平。结果:HFD喂养14周后,小鼠体质量(CD组vs.HFD组:t=-4.370,P=0.007)及脂肪体质量比(CD组vs.HFD组:t=-4.441,P=0.004)明显增加,血清和脂肪组织中TG、FFA水平均明显升高(CD组vs.HFD组血清FFA:t=-3.849,P=0.005血清TG:t=-2.768,P=0.039;脂肪组织FFA:t=-6.501,P=0.001;脂肪组织TG:t=-2.838,P=0.03)。与CD组相比,HFD组小鼠脂肪组织中炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein1,MCP1)蛋白表达明显上调(Western blot定量结果:TNF-α/actin:t=-19.261,P=0.000;MCP1/actin:t=-52.345,P=0.000)。葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验显示:HFD组小鼠空腹及葡萄糖负荷30、60、120 min时的血糖水平明显高于CD组(F=17.581,P=0.009);注射胰岛素后血糖水平都有所下降,但HFD组仍较CD组高(F=49.441,P=0.002)。小鼠脂肪组织中胰岛素信号通路及mTOR/S6K信号通路相关蛋白表达结果显示:HFD可增强mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化S6K(p-S6K)和丝氨酸(serine,Ser)磷酸化的IRS1[p-IRS1(Ser)]蛋白的表达,而降低总IRS1以及酪氨酸(tyrosine,Tyr)磷酸化的IRS1[p-IRS1(Tyr)]水平[Western blot定量结果CD组vs.HFD组:①IRS1/actin:t=28.460,P=0.000;②p-IRS1(Tyr632)/actin:t=30.343,P=0.000;③p-IRS1(Ser270)/actin:t=-16.473,P=0.000;④mTOR/actin:t=-5.067,P=0.007;⑤p-mTOR/actin:t=-13.525,P=0.000;⑥p-S6K/actin:t=-28.701,P=0.000]。Rapa作为mTOR信号通路特异性抑制剂,能明显抑制HFD诱导的p-S6K及p-IRS1(Ser)蛋白表达,并增加IRS1及p-IRS1(Tyr)蛋白水平[HFD+Veh组vs.HFD+rapa组:①IRS1/actin:t=-10.513,P=0.000;②p-IRS1(Tyr632)/actin:t=-19.879,P=0.000;③p-IRS1(Ser270)/actin:t=4.652,P=0.010;④p-mTOR/actin:t=19.306,P=0.000;⑤p-S6K/actin:t=9.393,P=0.001]。结论:HFD状态下,mTOR/S6K信号通路的异常激活可能是导致C57BL/6J小鼠脂肪组织中IRS1异常磷酸化的原因。

炎症对脂肪酸负荷的HepG2细胞FAT/CD36表达的影响

目的:观察炎症是否干扰脂肪酸负荷的人肝癌细胞系HepG2细胞脂肪酸转运蛋白/CD36(fatty acid transporter/CD36,FAT/CD36)的表达及脂质代谢。方法:分别给予不同浓度软脂酸(0.00、0.04、0.08、0.16、0.32 mmol/L)处理HepG2细胞24 h。采用Western blot和real-time PCR的方法检测HepG2细胞FAT/CD36的蛋白及mRNA的表达水平,再用油红O的方法观察细胞的脂质积聚情况。然后进一步选取0.04 mmol/L的软脂酸联合炎症因子[25 ng/ml的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)或20 ng/ml的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)]处理HepG2细胞24 h后,观察细胞FAT/CD36的蛋白表达情况,再用油红O和酶法检测细胞内的甘油三酯(triglyceride,TG)水平,ELISA检测细胞内游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)含量。结果:软脂酸呈浓度依赖性上调HepG2细胞FAT/CD36的蛋白(r=0.873,P=0.000)和mRNA表达(r=0.884,P=0.000)及细胞内脂质积聚。炎症因子TNF-α和IL-6能明显刺激脂肪酸负荷的HepG2细胞FAT/CD36的蛋白表达进一步增加(P值分别为0.001和0.000)。油红O染色显示炎症因子TNF-α和IL-6能明显促进HepG2细胞的脂质积聚,胞内TG定量检测也显示炎症因子能促进HepG2细胞的脂质积聚,其中软脂酸联合TNF-α组与对照组及软脂酸组相比,P值分别为0.009和0.037,软脂酸联合IL-6组与对照组及软脂酸组相比,P值均为0.000。胞内FFA定量检测结果与油红O染色和TG检测结果一致,也显示炎症因子能促进HepG2细胞的脂质积聚,其中软脂酸联合TNF-α组与对照组及软脂酸组相比,P值分别为0.001和0.002,软脂酸联合IL-6组与对照组及软脂酸组相比,P值均为0.000。结论:炎症因子可以上调HepG2细胞FAT/CD36的表达并加重细胞内的脂质积聚。